大花黃牡丹的開花特性與繁育系統

唐 英，袁 濤，陳庭巧

(北京林業大學 園林學院，國家花卉工程技術研究中心，城鄉生態環境北京實驗室，林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，花卉種質創新與分子育種北京市重點實驗室，北京 100083)

大花黃牡丹(Paeonialudlowii)，芍藥科芍藥屬牡丹組落葉灌木，主要分布于西藏林芝市巴宜區至米林縣海拔2 900～3 500 m的雅魯藏布江河谷及山坡林緣的狹長地帶，為中國西藏特有[1-2]，自然分布區內僅依賴種子繁殖后代，被列為極危(CR A2c)等級[3]，其株形高大、花色金黃且一枝多花，是牡丹新品種培育主要的目標性狀。

植物的開花特性可以從花部構成和花的開放式樣兩個層次來認識[4]。花部構成是指包括花的結構、顏色、氣味和蜜汁產量等單個花的所有特征；花的開放式樣是指花在某一時間開放的數量和在花序上的空間排列，可看作花在群體水平上表現出的特征[5]。繁育系統通常的定義是代表直接影響后代遺傳組成的所有有性特征[6]，是植物內部的遺傳機制和外部環境相互作用的一種表現形式,它們結合傳粉者和傳粉行為是影響生殖后代遺傳組成和適合度的主要因素，在決定植物的進化路線和表征變異上起著重要作用[7-8]。物種瀕危其實就是該種生活史中的一個或幾個環節受內外因素的影響出現危機而使生物個體數量下降的現象[7]，瀕危物種繁育系統的研究可探究其生殖過程中可能存在的致瀕原因，為瀕危植物的保護和利用提供參考。

芍藥屬牡丹組所有野生種均已列入《中國物種紅色名錄(第一卷)》，瀕危等級各異。大花黃牡丹是牡丹組中瀕危等級最高的種之一[3]。但僅四川牡丹(P.decomposita)、滇牡丹(P.delavayi)、‘鳳丹’(P.ostii‘Fengdan’)和矮牡丹(P.suffruticosasubsp.spontanea)，可見有關繁育系統類型或開花授粉特性的報道，四川牡丹和‘鳳丹’為混合交配系統，滇牡丹和矮牡丹為專性異交[9-12]。本研究觀測大花黃牡丹開花過程并進行人工授粉控制實驗，分析大花黃牡丹的開花特性和繁育系統類型，為解析可能影響其開花結實的因子，探討其原產地條件下瀕危的原因和資源開發利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 時間和地點

2019-2020年5～9月于河南省洛陽市欒川縣三川鎮(33.94°N，111.40°E；海拔1 300 m)進行。2019年10月至西藏自治區林芝市巴宜區米瑞鄉曲尼貢嘎村(29°29′59″N，94°37′01″E；海拔3 044 m)采收野生大花黃牡丹果實和種子。

1.2 材 料

試驗地內大花黃牡丹開花株共計666株，為采自西藏自治區林芝市米林縣南伊溝(29°19′10″N，94°20′25″E)的野生大花黃牡丹種子育成，2002年秋季播種，次年少量萌發成苗，2008年首次開花。2015年起疏于管理，每年僅夏季清除一次地面雜草。至2020年試驗地內大花黃牡丹植株最大株齡17年，平均株齡約10年，穩定開花。

1.3 方 法

1.3.1 花部特征與開花物候盛花期選取不同植株10朵花，測量每朵花的直徑，花瓣、苞片和萼片的長、寬及數量，雌雄蕊數量以及心皮長、寬、厚。隨機標記不同植株的頂蕾和側蕾各10個，觀測記錄露瓣、展瓣和落瓣的日期和天數。自試驗地第1朵花開放日起，每天記錄當天正值開放狀態的花朵數。

1.3.2 花粉-胚珠比(Pollen-ovule ratio,P/O) 在不同植株上選取即將開放的20個花蕾，每個花蕾取3枚花藥于開蓋離心管中自然散粉后，滴入蒸餾水制成4 mL花粉溶液，取1 μL花粉溶液于載玻片，顯微鏡下統計花粉粒數量，重復10次。最后計算每朵花的花粉數。解剖刀劃開心皮，統計胚珠數。單花花粉量=視野平均花粉數×稀釋倍數(4000)/3×花藥總數。

1.3.3 雜交指數(Outcrossing index，OCI) 取盛花期10朵花，測花朵直徑后觀測柱頭與花藥的空間位置，以最高的花藥與柱頭的位置為判斷依據，根據Dafni的標準[13]，計算雜交指數并判斷繁育系統類型。(1)花朵或花序直徑：<1 mm記為0，1～2 mm記為1，2～6 mm記為2，>6 mm記為3。(2)觀察花藥開裂與柱頭具可授性的時間先后：同時或雌蕊先熟記為0，雄蕊先熟記為1。(3)柱頭與花藥的空間位置：同一高度記為0，空間分離記為1。(1)-(3)累計得OCI 值。

1.3.4 花粉粒活力在不同植株上選取同日開放的5朵花并標記，從標記當天至花瓣落盡期間，每日9點分別采集花粉粒后立即檢測。將花粉粒均勻散布于載玻片，滴1滴0.5% TTC溶液，蓋上蓋玻片置于40 ℃恒溫處理10 min后，顯微鏡(N-117M型)觀察，每個載玻片取3個40倍的視野計數，紅色花粉粒為有活力，未染色的花粉粒為無活力。花粉活力=紅色花粉數/總花粉數×100%。

1.3.5 柱頭可授性每天隨機選取3朵當日開放的花朵標記并套袋，直到第1天標記套袋的花朵柱頭完全變黑，最后1天剪取所有標記花朵的柱頭和3個露瓣透色花朵的柱頭。柱頭取回后，裝入離心管并按日期順序分3組。每個離心管依次倒入1 mL現場配制的聯苯胺-過氧化氫溶液(聯苯胺∶3%過氧化氫∶蒸餾水=4∶11∶22)，5 min后記錄顯色和氣泡變化。

1.3.6 人工控制授粉實驗2019年，隨機選取不同株的開花枝，設置8組處理，每組10朵：(1)自然授粉(對照)： 隨機選取并標記10個透色頂花蕾，不做任何處理；(2)自然授粉：隨機選取并標記10個透色側花蕾，不做任何處理；(3)直接套袋：隨機選取10個透色頂花蕾，套硫酸紙袋并標記，(4)去雄套袋：隨機選取10個透色頂花蕾，去雄后套上硫酸紙袋并標記；(5)直接套網袋：隨機選取10個透色頂花蕾，不去除雄蕊，直接套防蟲網袋并標記；(6)同株異花授粉：隨機選取10個透色頂花蕾，去雄后套上硫酸紙袋并標記；3 d后授以所在植株上其他花朵的花粉；(7)異株異花授粉：隨機選取10個透色頂花蕾，去雄后套上硫酸紙袋并標記；3 d后授以不同植株的花粉；(8)花頭朝向處理：隨機選取10個透色頂花蕾，用小木棍支撐花莖使自然下垂的花朵直立向上，并標記。

2020年較2019年增加如下處理組，每組隨機選取15個透色頂花蕾：(1)僅去除雄蕊并標記；(2)去除雄蕊，套防蟲網袋并標記；(3)僅去除花冠并標記；(4)去雄蕊+去花冠并標記。

2019年9月、2020年9月蓇葖果變色時采收，計算結果率和結實率。結果率=(結實花朵數/處理花朵數)×100%，結實率=(飽滿種子/胚珠數)×100%。

1.3.7 訪花昆蟲隨機選取3朵花，從開花第1天至花瓣落盡期間，每天6:00-7:00、8:00-9:00、10:00-11:00、12:00-13:00、14:00-15:00和16:00-17:00拍攝、記錄訪花昆蟲的種類、訪花行為和訪花時長，捕捉訪花昆蟲制作標本用于鑒定。

2 結果與分析

2.1 開花特性和泌蜜現象

2.1.1 開花特性大花黃牡丹每個開花枝著花1～4朵，生于枝頂(頂花)和葉腋(側花)。單花直徑78.65～106.84 mm，花瓣10～13枚，苞片2～6枚，萼片4～6枚，心皮1～2個(表1)。通常頂花最先開放，隨后同枝的側花從下往上依次開放(圖1，A)。花朵晝夜開放程度不一，可見晝開夜合現象(圖2)。花頭通常在花冠閉合時傾斜朝上，隨著花冠展開而緩慢下垂，然后在花冠逐漸閉合的同時又慢慢回升(圖3)；下雨時光線變暗花冠也會適度閉合且下垂。群體花期后期開花畸形多，少數無雌蕊或3心皮，雄蕊、花瓣易脫落，有的花冠成杯狀不能完全展開。

2.1.2 泌蜜現象花朵開放前花蕾表面無可見花蜜，開放后有淡香。花絲、花藥、雌蕊子房與花瓣之間部位可見花蜜(圖1，B、C)，后者花蜜量較大，花絲和花藥上的花蜜則呈細小水珠狀零星分布。前1天傍晚去除雄蕊套上硫酸紙袋，第2天早晨在子房與花瓣之間仍可見花蜜，用移液槍吸取花蜜后再次套硫酸紙袋以排除訪花昆蟲吸食花蜜和花蜜蒸發，次日僅少量花朵在同一位置仍有花蜜，大部分花朵已無可見花蜜。觀察結果顯示大花黃牡丹具花內蜜腺，泌蜜部位應主要在子房與花瓣之間。并非所有花朵都可見花蜜，花梗較短、葉片顏色偏黃的花朵較難觀察到花蜜，長勢較弱、花期短的花朵花蜜量明顯少于正常花朵。

2.2 開花物候

2.2.1 群體花期2019年試驗地大花黃牡丹群體花期5月17日開始，6月19日結束，持續34 d(圖4)，為集中開花模式。其中5月24日～5月30日，每日正值盛開的花朵數均超過200，5月27日達到峰值250朵。

2.2.2 單花花期參考楊翔[14]的方法，根據花朵開放過程中的形態變化，將單花開放過程(單花花期)劃分為露瓣期、展瓣期、落瓣期3個時期(圖5，表2)。2019年，平均單花花期為(8.95±1.28) d，其中頂花單花花期(8.70±0.95) d，側花(9.20±1.55) d。側花的展瓣期與頂花相同，為5.4 d，側花的露瓣期和落瓣期都較頂花長，故側花單花花期略長于頂花。

A. 開花順序為1→2→3(1為頂花，2和3為側花)；B、C. 花蜜位置(紅圈示花蜜及位置)圖1 大花黃牡丹花朵開放次序(A)以及花蜜位置(B、C)A. The order is 1→2→3 (1 is top flower. 2 and 3 are side flowers); B and C. Nectar location of P. ludlowii (Red circles indicate nectar and location)Fig.1 Flowering order on a branch and nectar location of P. ludlowii flowerlet

A、C、E和G依次為開花第1天、第2天、第3天和第4天7：00；B為開花第1天17:00；D、F為開花第2天、 第3天12:00；H為開花第4天的11:00圖2 大花黃牡丹晝夜開花動態A, C, E and G are 7:00 O’clock on the first, second, third and fourth day in florescence, respectively; B is 17:00 O’clock on the first day of flowering; D and F are 12:00 O’clock on the first and second day in florescence, respectively; H is 11:00 O’clock on the fourth day in florescenceFig.2 P. ludlowii flowers bloom day and night dynamic

A-H依次為開花第2天7:00(花朵直立向上)，8:00(花朵微傾斜朝上)，9:00(花朵傾斜朝上)，10:00(花朵朝上，傾斜程度增大)， 12:00(花朵傾斜朝下)，14:00(花朵朝下，傾斜程度增加)，15:00(花朵朝下，傾斜程度減小)和17:00(花朵傾斜朝上)圖3 大花黃牡丹同一天內花朵朝向變化A-H are 7:00 O’clock (Flower stands upright), 8:00 O’clock (flower tilts slightly upward), 9:00 O’clock (flower tilts upward), 10:00 O’clock (flower tilts upward, increasing in inclination), 12:00 O’clock (flower tilts down), 14:00 O’clock (flower tilts down, increasing in inclination), 15:00 O’clock (flower tilts down, decreasing in inclination) and 17:00 O’clock (flower tilts upward) on the second day, respectivelyFig.3 Changes in P. ludlowii flowers facing-orientation within a day

表1 大花黃牡丹花部形態指標

圖4 試驗地大花黃牡丹的群體花期(2019年)Fig.4 The groups florescence of P. ludlowii in Luanchuan, Henan province in 2019

2.3 花粉活力與柱頭可授性檢測

表3顯示，大花黃牡丹開花第1天時花粉粒不具活力，第3天花粉活力最強，為(93.86±3.10)%；第4天花粉活力仍較強，為(91.37±1.66)%；第7天花瓣開始脫離，花藥由鮮黃色變深并逐漸干癟，花粉粒不再具有活力。柱頭可授性檢測結果(表4)發現，開花前1天，花朵呈透色狀態，此時已具可授性，開花第3天(展瓣期)和第4天(展瓣期)可授性最強，至第12天(花瓣落盡)起柱頭可授性消失。大花黃牡丹花粉活力最好的時期與柱頭可授性最強的時期高度重合，皆在開花第3天和第4天，故本研究認為此時是人工雜交授粉最佳時期。

2.4 繁育系統檢測

2.4.1 花粉-胚珠比按照Cruden的標準[15]：P/O為2.7～5.4時，為閉花受精；P/O為18.1～39.0時，為專性自交；P/O為31.9～396.0時，為兼性自交；P/O比為244.7～2 588.0時，為兼性異交；P/O比為2 108.0～195 525. 0時，為專性異交。

由表5可知，大花黃牡丹單花平均292個花藥(最多399個、最少211個)，6 770 333粒花粉(最多10 237 333粒，最少3 461 333粒)，20個胚珠(最多29個，最少9個)。P/O為119 356.31～731 238.07，平均P/O有375 502.28，20組單花P/O中僅編號15和17在2 108.0～195 525. 0之間，其余組和平均值均超出Cruden的標準范圍。

A.未露瓣花蕾；B、C.露瓣期；D-I.展瓣期；J-L.落瓣期圖5 大花黃牡丹單花開放進程A. Flower buds whose petals are not exposed; B, C. Petal-appearing period; D-I. Opening petal-opening period； J-L. Falling petal-falling periodFig.5 The single flower blooming process of P. ludlowii

2.4.2 雜交指數根據Dafni[13]的標準：OCI = 0為閉花受精；OCI = 1為專性自交；OCI = 2為兼性自交；OCI = 3為自交親和，有時需要傳粉者；OCI = 4為異交、部分自交親和、需要傳粉者。表6顯示，大花黃牡丹OCI值為4，初步判斷其繁育系統類型為異交、部分自交親和、需要傳粉者。

2.4.3 人工控制授粉2020年，試驗地內大花黃牡丹開花數量較2019年多，但部分花蕾不展開，雄蕊脫落，結果率與結實率顯著低于2019年(表7)，同一授粉處理的結實情況也差異較大(表8)。

2019年試驗地自然授粉的結實率為(32.50±8.29)%，略高于同年西藏林芝巴宜區米瑞鄉(29.01±15.57)%，但2020年試驗地頂花結果率和結實率分別為46.67%、(14.33±6.26)%，較 2019年的100%、(33.75±9.10)%下降明顯。2020年側花結果率100%，側花結實率(19.02±9.54)%，側花結實率雖比2019年(31.25±7.67)%低，但仍高于2020年頂花的結實率(14.33±6.26)%，且連續兩年所有側花均全部結果；說明側花的開花結實比頂花穩定，雜交時可優先給側花授粉。

去雄套袋組2019年既結實又有正常種子，結實率(31.48±5.56)%，而2020年結實為0，說明大花黃牡丹可能存在不穩定的無融合生殖。但牡丹組中僅見四川牡丹具微弱無融合生殖的報道[9]，其無融合生殖需要進一步確認。

表2 大花黃牡丹單花花期(2019年)

表3 大花黃牡丹花粉粒活力日變化

直接套袋組和同株異花授粉組2019年與2020年皆有結實，自交結實率分別為(32.18±9.02)%、(15.52±6.24)%，可知大花黃牡丹具自交親和性。網袋組2019年結實率為(30.21±5.79)%，略低于對照組的(33.75±9.10)%；2020年網袋組結實率(18.21±8.46)%，高于對照組的(14.33±6.26)%，但無顯著性差異。2020年同株異花授粉的結實率為(16.95±5.93)%，異株異花授粉的結實率為(14.64±4.62)%，與對照組無顯著性差異。

去花冠組的結實率為(18.46±8.69)%，略高于對照組。僅去雄組、去雄套網袋組和去雄蕊+去花冠組均未結實，去除雄蕊會嚴重影響傳粉過程。去除雄蕊意味著花粉喪失，花朵既不能自花授粉，又失去傳粉報酬，大大降低了其傳粉成功的概率。花冠朝上組2019年與2020年的結實率分別為(33.75±8.66)%和(14.38±7.20)%，與同年對照組的結實率近乎一致。

表4 大花黃牡丹雌蕊柱頭可授性日變化

表5 大花黃牡丹的花粉-胚珠比

表6 大花黃牡丹的雜交指數

表8 大花黃牡丹不同授粉處理的結果

表7 原生地與試驗地自然授粉的結實率

2.5 訪花昆蟲

試驗地內大花黃牡丹花期訪花昆蟲共16種(表9)，其中膜翅目(Hymenoptera)3種，雙翅目(Diptera)4種，半翅目(Hemiptera)4種，鞘翅目(Coleoptera)4種，蜘蛛目(Araneae)1種。主要訪花昆蟲有膜翅目的意大利蜜蜂(Apismelliferali-gustica)、蘆蜂(Ceratinasp.)和隧蜂(Halictussp.)以及雙翅目的灰帶管蚜蠅(Eristaliscerealis)和黑帶食蚜蠅(Episyphusbalteatus)。

表9 大花黃牡丹訪花昆蟲種類及訪花行為

圖6 大花黃牡丹不同時段訪花昆蟲的訪花頻率Fig.6 The visiting frequency of pollinators in different periods of P. ludlowii flowering

2.5.1 不同種類訪花昆蟲的訪花行為、訪花次數及時長膜翅目訪花昆蟲的主要訪花行為是采集花粉，雙翅目既吸食花蜜又采花粉。鞘翅目主要吸食花蜜，半翅目多在花上休憩，花蜜和花粉不是鞘翅目昆蟲的訪花目的，寄蠅(Tachinasp.)和蟻珠(Myrmarachnesp.)也只是在花上停留。膜翅目訪花次數、訪花時長在所有訪花昆蟲中居首位，其中意大利蜜蜂訪花最勤，觀察期內共訪花122次，單次訪花時長(109.58±222.44)s；其次是隧蜂，訪花82次，平均每次(151.79±258.07)s；蘆蜂訪花22次，單次停留(207.72±280.24)s。灰帶管蚜蠅和黑帶食蚜蠅訪花次數相近，分別有30次和32次，但黑帶食蚜蠅單次訪問時間近1.5 min，灰帶管蚜蠅單次停留時間不足1 min。4種鞘翅目訪花昆蟲雖然訪花次數不多，但滯留時間較長，單次訪花時長均超過2 000 s。

2.5.2 不同時段訪花昆蟲的訪花頻率由圖6可知，訪花昆蟲在開花后第2天的訪花頻率最高，每小時可訪問20次；開花后第3天訪問頻率次之，每小時訪問13次。一天中訪花次數最多的時段是8:00-9:00，共計103次。開花第2天的8:00-9:00訪花次數高達46，為各時段最高，其次是開花第3天的8:00-9:00，訪花次數為43。10:00-11:00這一時段的訪花頻率也不低，每小時14次，合計訪花70次。

3 討 論

3.1 大花黃牡丹的繁殖保障

植物與其傳粉者的相互作用被認為是被子植物花進化的重要推動力，相互作用表現在花部特征對訪問者行為和花粉傳遞機制的影響，被訪問者傳送的花粉數量和質量又反作用于植物作為雌性或雄性親本的生殖成功[16]。花自身的結構特點、展示、設計方式及引誘傳粉者的能力是影響植物繁殖成功的重要因子[17]。植物個體開花物候(開花持續時間和開花強度格局)常在兩個極端之間變化，即集中開花模式和持續開花模式，一般認為，集中開花模式有利于物種吸引更多昆蟲，有助于傳粉成功[18]。大花黃牡丹花大，花色明黃，花香清淡、集中開花可增強其對傳粉者的吸引力。花粉和花蜜富含營養，可作為傳粉者訪花報酬補償其能量消耗[19]。大花黃牡丹分泌花蜜，單花花粉量(3 461 333～10 237 333)大，花朵下垂可避免雨水沖刷造成的花粉損失，有效增加訪花昆蟲的訪問頻率。

暫時性花閉合是花對環境條件如雨水、露水、低溫、風或有限的傳粉者的響應，是為保護植物繁殖器官及提高繁殖成功而進化出的花部機制[20-21]。晝開夜合的開放方式可節約能量，延長花壽命[7]，大花黃牡丹這一開放方式有效地保護了其花朵壽命。其展瓣期為(5.40±0.75)d，且期間花粉活力為(76.97±4.50)%～(93.86±3.10)%，柱頭可授期長達12 d，延長了授粉時間。花粉活力和柱頭可授性因植物而異，花粉與柱頭同時處于高度活力狀態，有利于植物順利完成授粉、識別、受精過程[18]。大花黃牡丹大部分花藥高于柱頭，花粉活力最好與柱頭可授性最強時期高度重合(開花后第3、4天)，在此期間，以采集花粉為主要行為特征的3種膜翅目昆蟲訪花次數、訪花時長在所有訪花昆蟲中居首位，花蜜也吸引了雙翅目和鞘翅目訪花昆蟲，昆蟲種類多，行為活躍，這些都增加了授粉成功的機率。大花黃牡丹的花部綜合特征、性器官壽命和花開放式樣、訪花昆蟲為其傳粉過程提供了較充分的保障。

盡管如此，對比原產地和本試驗2年的數據，大花黃牡丹自然授粉結實率只在(17.52±8.77)%～(32.50±8.29)%之間。改變傳粉條件如去除花冠、適度阻斷空氣流動(直接套硫酸紙袋)、阻斷傳粉者訪花(套網袋)以及改變花朵朝向，并未顯著降低結實率，人工保障授粉(同株異花和異株異花授粉)也沒有顯著提高結實率。2年的試驗結果也顯示其可自交結實，側花比頂花結實更穩定，本研究試驗中還觀察到大花黃牡丹無融合生殖現象。這些表明，大花黃牡丹的交配機制可能比我們認為的更靈活，既可異交授粉結實又可自交結實，開花特性又有多重保障機制。故本研究認為，大花黃牡丹結實率的主要影響因子可能不在于傳粉過程和交配機制，可能與傳粉后受精、果實或種子發育過程等因素有關，還需今后擴大實驗數量并結合更多方法深入研究。

另外，根據李嘉玨等的報道，甘肅榆中和平牡丹園引種栽培4年的大花黃牡丹植株，每年人工澆水、噴施磷酸二氫鉀3次，其套袋觀察結果顯示自花授粉結實率為66.7%[22]，本試驗自花結實率遠低于這一數據的原因也可能與試驗地點疏于管理有關。

3.2 大花黃牡丹的繁育系統類型及意義

本研究獲得的大花黃牡丹的20組P/O數據，僅2組數據P/O值在Cruden的標準內[15]，其他各組數據遠超出評判標準P/O值。駱勁濤的研究發現，四川牡丹的P/O(120 000～270 000)，也僅部分數據在Cruden標準范圍內[9]，鑒于此，結合OCI值和人工控制授粉實驗結果，綜合判斷，本研究對大花黃牡丹繁育系統類型的判斷與四川牡丹一致[9]：即異交、部分自交親和、需要傳粉者的混合交配系統。羅長維等、李奎等發現牡丹組‘鳳丹’P/O(58 940)和滇牡丹P/O(6 124～9 713)雖都在專性異交的標準范圍，但‘鳳丹’OCI和授粉實驗結果顯示其繁育系統為以異交為主，自交部分親和，傳粉過程需要傳粉者[10-11]，雖然‘鳳丹’P/O值與大花黃牡丹和四川牡丹差異較大，但三者的繁育系統類型一致。滇牡丹的繁育系統則為專性異交型，且和矮牡丹一樣被認為是異花授粉植物，即使它們存在微弱的自交性[10, 12]。有意義的是，大花黃牡丹、四川牡丹和‘鳳丹’都是專性有性繁殖的種類，自然界僅依賴種子繁殖，混合交配系統更有利多產種子；而滇牡丹和矮牡丹為兼性營養繁殖的種類，以多種形式的營養繁殖為主，種子繁殖為輔。即使專性異交，其繁殖特性也可保證后代數量。芍藥屬繁育系統研究范圍可進一步擴大到其他種類，以全面分析該屬繁育系統類型多樣性的原因及與自然繁殖特性的內在聯系。

訪花昆蟲中雙翅目和鞘翅目都吸食花蜜，雙翅目同時也采集花粉，花蜜是否影響其P/O值尚待深入探討。除大花黃牡丹外，滇牡丹[10]花朵、芍藥(Paeonialactiflora)品種[23]的花蕾也有分泌花蜜的報道。芍藥屬植物是否具有典型的花蜜腺及其類型、具體位置和泌蜜規律有待進一步研究。

3.3 依據P/O判斷繁育系統類型的適用性

目前判斷植物繁育系統類型，都會將P/O值作為依據之一，但P/O值在繁殖生物學、授粉生態學、系統分類學等方面的應用未必完全適用于所有分類群[24]。Cruden采用的大多是親緣關系較遠的種類歸納P/O的范圍[15, 25]，涉及物種范圍有限。且其歸納的標準除閉花受精外，每兩個相鄰類型的P/O范圍都有重疊，對于P/O值介于重疊部分的物種此標準不具精確性。花和花序的構造特性、授粉有效性以及生境等會影響P/O值的大小，而親緣關系近的種間不同的演化史，致使其P/O值差異非常大的情況下，也可能具有相似的繁育系統[26]。如天目地黃(Rehmanniachingii)和湖北地黃(R.henryi)的P/O值顯示其繁育系統類型為兼性自交，裂葉地黃(R.piasezkii)和地黃(R.glutinosa)為兼性異交，事實上這4種地黃均屬于異交，部分自交親和，需要傳粉者的類型[27]。有些植物，如榕屬植物因花粉粒細小，曾喜育采用花藥-胚珠比(A/O)代替P/O研究其繁育系統[28]，作為區分繁育系統差異的參考。本研究試圖計算大花黃牡丹的A/O值，但未得到可供分析比較的結果。

大花黃牡丹P/O超出標準范圍并非個例。東北地區野豌豆屬均為自花授粉植物，其P/O 超出 Cruden 標準中自花授粉的閥值，多數種類P/O值低于1 000，少數種類高于1 000[29]。鳳仙花科(Balsaminaceae)中各個繁育系統類型都存在極高的P/O值，僅部分符合分類標準[30]，華北駝絨藜(Ceratoidesarborescens)P/O(1 351 189 ± 391 779)遠超Cruden的標準[31]。另外，盡管有些物種的P/O值沒有超出標準范圍，根據P/O判斷的繁育系統類型卻與實際情況不符，如百子蓮(Agapanthuspraecoxsubsp.orientalis‘Big Blue’)[32]、喜樹(Camptothecaacuminata)[33]、華北藍盆花(Scabiosatschiliensis)[34]和吉首蒲兒根(Sinoseneciojishouensis)[35]等。Chouteau在研究天南星科(Araceae)Philodendron屬23個種和Anthurium屬20個種的P/O后甚至指出，P/O可能與其研究對象的繁育系統沒有直接聯系[36]。因此，植物繁育系統的判斷，花粉/胚珠(P/O)可視為參考指標，而不是唯一的判斷指標。