腎石通顆粒對大鼠草酸鈣結(jié)石模型的藥效作用及機(jī)制研究

姜文月，韓淑麗，唐明哲，高 陸，曲佳樂，李 敏，李鵬東*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院(清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院)，廣東 清遠(yuǎn) 511500； 2.吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，吉林 長春 130012)

泌尿系統(tǒng)結(jié)石屬于中醫(yī)學(xué)“淋證”“石淋”范疇，其臨床以小便頻數(shù)短澀、滴瀝刺痛、淋漓不盡、小腹拘急或痛引腰腹，甚者尿出砂石為特征[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，結(jié)石的形成受到諸多因素影響，包括自然環(huán)境、社會(huì)生活條件、飲食結(jié)構(gòu)習(xí)慣、泌尿系局部隱患、全身代謝紊亂等。泌尿系統(tǒng)梗阻、泌尿系統(tǒng)感染、泌尿結(jié)石三者互為因果。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為結(jié)石的形成原因有：①濕熱蘊(yùn)結(jié)，治則：清熱利濕；②氣滯血瘀，治則：行氣活血；③陽虛氣弱，運(yùn)化無力，治則：溫陽利水；④脾腎虧虛，治則：健脾補(bǔ)腎。

西醫(yī)常采用碎石或手術(shù)取石等對癥治療的方法治療腎結(jié)石，治愈后復(fù)發(fā)率高。而中醫(yī)常采用對因與對癥治療相結(jié)合的方法，其特色在于將改善體質(zhì)、消除結(jié)石病理狀態(tài)與促進(jìn)排石相結(jié)合，故中醫(yī)藥辨治及預(yù)防泌尿結(jié)石前景較為廣闊[3]。

腎石通顆粒是由金錢草、王不留行、萹蓄、延胡索、雞內(nèi)金、丹參、木香、瞿麥、牛膝及海金沙10味藥材組成，具有清熱利濕、活血止痛、化石、排石的藥效作用，用于腎結(jié)石、腎盂結(jié)石、膀胱結(jié)石、輸尿管結(jié)石等。目前，腎石通顆粒治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石臨床應(yīng)用廣泛、藥效確切。例如，劉小勇等[4]報(bào)道了腎石通顆粒聯(lián)合鹽酸坦洛新緩釋膠囊治療輸尿管下段結(jié)石的臨床療效。王小娟[5]報(bào)道了腎石通顆粒配合經(jīng)皮腎鏡鈥激光碎石術(shù)治療多發(fā)性腎結(jié)石的臨床療效。夏志國[6]報(bào)道了腎石通顆粒對體外沖擊波碎石術(shù)后腎損傷的保護(hù)作用。施源等[7]報(bào)道了腎石通顆粒配合輸尿管硬鏡鈥激光碎石加ESWL治療腎盂結(jié)石的臨床療效。吳江琳[8]對腎石通顆粒結(jié)合震波碎石治療225例中重度泌尿系統(tǒng)結(jié)石患者臨床療效進(jìn)行了報(bào)道。孫法元[9]對腎石通顆粒治療296例泌尿系結(jié)石的臨床療效進(jìn)行了報(bào)道。但目前鮮見腎石通顆粒治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石作用機(jī)制的研究報(bào)道。本研究采用乙二醇及氯化銨聯(lián)合造模建立大鼠草酸鈣結(jié)石模型，通過觀察腎臟組織病理變化、大鼠尿液pH值、尿鈣、尿草酸含量，以及血清中鈣離子、尿素氮、肌酐、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、前列腺素E2(PGE2)等指標(biāo)含量，探討腎石通顆粒治療結(jié)石的藥效及其作用機(jī)制，以期為臨床科學(xué)合理使用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220g，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK (吉)-2018-0007。

1.2 藥物與試劑

腎石通顆粒(修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：180301)；排石顆粒(南京同仁堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：180401)；氯化鈉注射液(吉林省都邦藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1705130411)；乙二醇(北京化工廠，批號(hào)：20160218)；氯化銨(北京化工廠，批號(hào)：20111122)；水合氯醛(沈陽市試劑三廠，批號(hào)：20131204)；甲醛溶液(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號(hào)：201815)；肌酐測試盒、尿素氮測試盒、鈣測試盒、白介素-2測試盒、前列腺素E2測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

Spectra Max Plus 384型酶標(biāo)儀(美國美谷分子儀器有限公司))；6100型紫外分光光度計(jì)(北京普源精電科技有限公司)；TDZ5-WS臺(tái)式低速多管自動(dòng)平衡離心機(jī)(長沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司)；JY2003電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)藥物腎石通顆粒規(guī)格及臨床用量為：15 g/袋，1次1袋，1日2次。按照60 kg/人計(jì)算：30 g/60 kg=0.5 g/kg，換算大鼠給藥劑量為0.5×6.25=3.12 g/kg。本實(shí)驗(yàn)設(shè)立腎石通顆粒低劑量組(1.56 g/kg)、中劑量組(3.12 g/kg)、高劑量組(6.24 g/kg)。

本實(shí)驗(yàn)以排石顆粒作為陽性對照藥，排石顆粒規(guī)格及臨床用量為：5 g/袋，1次1袋，1日3次。按照60 kg/人計(jì)算：15 g/60 kg=0.25 g/kg，換算大鼠給藥劑量為0.25×6.25=1.56 g/kg，即陽性藥-排石顆粒組給藥劑量為1.56 g/kg。

2.2 建立大鼠草酸鈣結(jié)石模型及檢測[10-11]

60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥-排石顆粒組(1.56 g/kg)、腎石通顆粒低劑量組(1.56 g/kg)、中劑量組(3.12 g/kg)、高劑量組(6.24 g/kg)6組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，除正常組外，其余組大鼠采用乙二醇及氯化銨聯(lián)合造模：每日自由飲用1%乙二醇，同時(shí)每日灌胃2%氯化銨(2 mL/只)。從造模第一日起給藥，28 d后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天禁食不禁水，用代謝籠收集每只大鼠24 h尿液，測定尿pH值、尿鈣、尿草酸含量；末次給藥1 h后，各組大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心取上層血清，測定鈣離子、尿素氮、肌酐、IL-2及PGE2含量；取雙腎及膀胱，分別稱量質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)；雙腎10%甲醛溶液固定，石蠟切片，蘇木精及伊紅染色(H&E)，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用雙側(cè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 腎臟組織病理檢查結(jié)果

如圖1所示，正常組大鼠腎臟組織未見藍(lán)染結(jié)晶體(草酸鈣結(jié)晶)，腎小球內(nèi)的毛細(xì)血管未見擴(kuò)張，未見腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，腎間質(zhì)未見血管充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤。與正常組比較，模型組有明顯藍(lán)染結(jié)晶團(tuán)，腎小管上皮細(xì)胞重度水腫、變性。與模型組比較，腎石通顆粒低、中、高劑量組藍(lán)染結(jié)晶體均減少，尤其是中、高劑量組藍(lán)染結(jié)晶體明顯減少，且腎小管上皮細(xì)胞水腫、變性減輕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腎石通顆粒可抑制結(jié)石形成，改善腎臟組織損傷。

圖1 腎臟組織病理檢查結(jié)果

3.2 尿液及血清指標(biāo)檢測結(jié)果

尿液指標(biāo)(見表1)：與正常組比較，模型組尿pH值明顯降低(P<0.01)，尿草酸及尿鈣水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥-排石顆粒組、腎石通顆粒低、中、高劑量組對尿pH值、尿草酸及尿鈣水平均顯著回調(diào)(P<0.05，P<0.01)。

表1 尿液各指標(biāo)檢測結(jié)果

血清指標(biāo)(見表2)：與正常組比較，模型組血清尿素氮、肌酐、鈣離子、IL-2及PGE2水平均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，腎石通顆粒低劑量組對血清尿素氮、鈣離子、IL-2及PGE2水平顯著下調(diào)(P<0.01)，陽性藥-排石顆粒組、腎石通顆粒中劑量及高劑量組對血清各項(xiàng)檢測指標(biāo)均有顯著改善(P<0.01，P<0.05)。

表2 血清各指標(biāo)檢測結(jié)果

綜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腎石通顆粒顯著降低尿液中草酸含量、提高尿液pH值，堿化尿液；降低尿液及血清中鈣離子含量，抑制結(jié)石形成；降低血清IL-2及PGE2水平，減輕腎臟炎癥；降低血清尿素氮及肌酐含量，增強(qiáng)腎小球?yàn)V過，改善腎功能。

3.3 臟器指數(shù)檢測結(jié)果

如表3所示，與正常組比較，模型組腎臟指數(shù)及膀胱指數(shù)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥-排石顆粒組、腎石通顆粒低、中、高劑量組腎臟指數(shù)及膀胱指數(shù)均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腎石通顆粒組可明顯抑制因結(jié)石引起的組織水腫及腎臟、膀胱質(zhì)量增加。

表3 臟器指數(shù)檢測結(jié)果

4 討論

泌尿系結(jié)石病為泌尿系常見病之一，可發(fā)生于泌尿系統(tǒng)任何部位，多原發(fā)于腎臟。腎結(jié)石成分中80%約為含鈣結(jié)石，而草酸鈣結(jié)石約占含鈣結(jié)石的80%[12]。乙二醇是草酸代謝的前體，在體內(nèi)經(jīng)過羥乙酸途徑可不斷轉(zhuǎn)換成草酸，誘導(dǎo)大鼠形成高草酸尿。氯化銨具有腎毒性作用，可直接損傷腎小管上皮細(xì)胞，且氯化銨亦具有酸化尿液作用，利于草酸鈣晶體形成[4]。

尿素氮是血漿中除蛋白質(zhì)外的一種含氮化合物，它從腎小球?yàn)V過而排出體外。在腎功能不全失代償時(shí)，血清尿素氮將升高。肌酐幾乎均經(jīng)腎小球?yàn)V過進(jìn)入原尿，且不被腎小管重吸收。內(nèi)源性肌酐每日生成量基本保持恒定，嚴(yán)格控制外源性肌酐攝入時(shí)，血肌酐濃度為穩(wěn)定值，因此，臨床將尿素氮及肌酐作為判斷腎小球?yàn)V過功能的指標(biāo)[13]。高血鈣可產(chǎn)生高尿鈣，從而導(dǎo)致結(jié)石形成，高尿鈣是草酸鈣腎結(jié)石形成極為重要的生理病理因素，異常升高的Ca2+，增加了尿液中成石離子活性，并與負(fù)載的草酸結(jié)合形成草酸鈣結(jié)晶，過飽和的草酸鈣結(jié)晶在損傷的腎小管上皮細(xì)胞基底膜不斷沉積形成鈣化斑，最終聚集形成草酸鈣結(jié)石[14]。

IL-2可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化、調(diào)節(jié)免疫、參與炎癥。而PGE2可誘發(fā)炎癥，增加疼痛敏感性。

本研究通過檢測上述指標(biāo)成分，從防石、溶石及抗炎護(hù)腎三方面考察了腎石通顆粒的藥效及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腎石通顆粒可降低尿液pH值、草酸含量，堿化尿液，表明具有溶石作用；降低尿液及血清中鈣離子，抑制結(jié)石形成，表明具有防石作用；降低血清尿素氮及肌酐含量，增強(qiáng)腎小球?yàn)V過功能、改善腎功能，且調(diào)節(jié)IL-2及PGE2水平，抑制腎臟炎癥，降低鎮(zhèn)痛敏感性，表明具有抗炎護(hù)腎作用。