正交試驗優化馬鞭草中馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷的水提取工藝

劉園園，崔柏寧，李棣華

(1.天津城市職業學院，天津 300250；2.天津中醫藥大學，天津 301617； 3.天津市南開醫院，天津 300100)

馬鞭草為馬鞭草科植物馬鞭草VerbenaofficinalisL.的干燥地上部分，具有活血散瘀、利水、退黃、截瘧等功效，可用于治療癥瘕積聚、痛經經閉、喉痹等癥[1-2]。現代研究表明，馬鞭草中馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷具有抗氧化、保肝、保護神經[3]、保護心臟及腦缺血[4]、抗炎[5]等多種作用。馬鞭草野生資源豐富[6]，分布地較為廣泛，可提取出具有多種功效的生理活性成分。因此，研究從馬鞭草中提取馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷的工藝具有非常重要的價值。

1 儀器與材料

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；JA3003電子天平 (上海菁海儀器有限公司)；數顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；DHG-9240A烤箱；KDM型調溫電熱套(天津市靜海縣工興電器廠)；馬鞭草苷對照品(南京普儀生物科技有限公司)；戟葉馬鞭草苷對照品(南京普儀生物科技有限公司)；娃哈哈純凈水 (杭州娃哈哈集團有限公司)；乙腈 (Fisher公司，色譜級)；磷酸 (TED公司，色譜純)；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Orca C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：240 nm；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫：0～15 min，11%～13% A，15～17 min，13%～24%A，17～20 min，24%～12%A，20～25 min，12%A；體積流量：1 mL/min。

2.1.2 對照品溶液的制備 取馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷適量，分別精密稱定，加甲醇制成含馬鞭草苷0.61 mg/mL、戟葉馬鞭草苷0.54 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取馬鞭草藥材粉碎過40目篩，取粉末約0.5 g，精密稱定，準確加入蒸餾水25 mL，置具塞錐形瓶中，稱定重量，回流提取45 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用蒸餾水補足減失的重量，搖勻濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件記錄峰面積。以峰面積積分值(Y)對馬鞭草苷質量(X)作回歸曲線，得回歸方程：Y=699.047 6X+258.027 9(R2=0.999 4)，說明馬鞭草苷在0.61～12.2 μg范圍內線性關系良好；以峰面積積分值 (Y) 對戟葉馬鞭草苷質量(X)作回歸曲線，得回歸方程：Y=481.075 6X+196.254 1(R2=0.999 7)，說明馬鞭草苷在0.54～10.8 μg范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 取供試品溶液，連續進樣5次，按上述色譜條件測定馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷的色譜峰峰面積RSD值分別為2.92%和2.33%，表明本方法精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 分別在供試品制備后的0、2、4、6、8 h，精密吸取上述供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，分別記錄與馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷對應的標準品保留時間相同的色譜峰峰面積RSD值，分別為2.51%、2.76%。

2.1.7 重復性試驗 取同一批樣品6份，精密稱定，按“2.1.3”項下的方法平行制備，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣，連續重復進樣6次，測得色譜峰的保留時間，計算馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷含量的RSD值分別為1.94%、2.23%。

2.1.8 加樣回收率試驗 稱取已知含量的樣品0.25 g，精密稱定，共6份，每份分別精密加入馬鞭草苷177.5 μg和戟葉馬鞭草苷120.0 μg，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別測定與對應的馬鞭草苷標準品保留時間相同的色譜峰峰面積，計算加樣回收率為96.21%，RSD值為2.84%。同法測定戟葉馬鞭草苷的加樣回收率為95.74%，RSD值為2.55%。見圖1。

注：1.馬鞭草苷；2.戟葉馬鞭草苷。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比 取馬鞭草藥材10 g，加入蒸餾水回流提取2 h，提取1次，考察料液比1∶10、1∶12、1∶14、1∶16對提取效果的影響。由表1可知，隨著料液比中提取液的增加，馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷的總量逐漸增加，但料液比越小，提取液越多，越不利于濃縮，因此正交試驗選擇的料液比是1∶10、1∶12及1∶14。

表1 不同料液比與提取物的含量 (n=2)

2.2.2 提取時間 取馬鞭草藥材10 g，按料液比1∶14加入蒸餾水回流提取，提取1次，考察提取時間1 h、1.5 h、2 h、2.5 h對提取效果的影響。由表2可知，隨著提取時間的延長，馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷的總量逐漸增加，提取時間對馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷的含量影響較小，因此選擇2 h進行單因素考察。

表2 不同提取時間與提取物的含量 (n=2)

2.2.3 提取次數 取馬鞭草藥材10 g，按料液比1∶14加入蒸餾水回流提取2 h，考察提取次數1、2、3、4次對提取效果的影響。由表3可知，隨著提取時間的延長，馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷的總量逐漸增加，考慮到經濟因素，建議提取次數不要超過3次。

表3 不同提取次數與提取物的含量 (n=2)

2.3 正交試驗

根據單因素試驗，選取料液比(A)、提取時間(B)及提取次數(C)為三因素設計L9(34)正交試驗，正交因素表見表4。

表4 正交試驗因素和水平

稱取馬鞭草10 g，連續稱取9份，按照L9(34)正交表的試驗條件進行試驗，以馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷的總量為指標，對提取工藝進行優化選擇，正交試驗設計表及結果見表5、表6。

表5 正交試驗設計

表6 方差分析

各因素對提取效果影響：C>A>B。最佳提取工藝：A3B2C3，即料液比為1∶14，每次1.5 h，提取3次。

2.4 驗證試驗

按上述優選出來的提取工藝A3B2C3，測定馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷總含量，平行實驗的結果為馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷總含量均值為1.004，表明優選的提取工藝條件符合預期結果，提取工藝穩定可行，正交試驗優選方案合理。結果見表7。

表7 驗證試驗結果

3 結語

自馬鞭草中提取的馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷屬于環烯醚萜苷類[7]成分，該類化合物分子量普遍較小，易吸收，且具有多種藥用作用[8]，因此馬鞭草被認為是一種很有價值的植物藥材。本研究利用正交試驗方法，優選出馬鞭草苷及戟葉馬鞭草苷的提取工藝，可為馬鞭草的開發和利用提供參考。