基于網絡藥理學探討消痛湯治療痛風的作用機制

胡子毅，張 平，李人亮，易 瑩，賴俊宇，陳麗莎

(1.江西中醫藥大學附屬醫院 急診科，江西 南昌 330006；2.江西中醫藥大學 臨床醫學院，江西 南昌 330004；3.江西中醫藥大學 中醫學院，江西 南昌 330004；4.江西中醫藥大學 心血管病科，江西 南昌 33006)

痛風是由單鈉尿酸鹽(MSU)沉積所致的晶體相關性關節病，與嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關，特指急性特征性關節炎和慢性痛風石疾病，主要包括急性發作性關節炎、痛風石形成、痛風石性慢性關節炎、尿酸炎腎病和尿酸性尿路結石，重者可出現關節殘疾和腎功能不全[1-2]。原發性痛風的病因和發病機制尚不明確，發病多與遺傳和環境因素相關。在我國各地區痛風的患病率為0.03%～10.47%[3]。目前臨床上對此病的干預主要依靠使用藥物和飲食控制相配合，嚴重者需行手術治療[4]。

消痛湯系蔣小敏教授治療痛風性關節炎的經驗方，其藥物組成：炒杜仲30 g，粉萆薢15 g，白術10 g，百合25 g，漢防己10 g，金錢草15 g，車前草15 g，威靈仙20 g土茯苓10 g，黃柏10 g，牡丹皮10 g，伸筋草15 g，忍冬藤30 g，生甘草6 g[5]。本課題組曾運用消痛湯加味對40例急性痛風性關節炎患者進行臨床研究，結果表明消痛湯治療急性痛風性關節炎具有較好的療效，且具有一定的降尿酸作用[6]。但由于中藥復方具有成分復雜和作用機理不清楚的特點，因此本研究擬采用網絡藥理學方法來探尋消痛湯中治療痛風可能存在的關鍵活性成分和作用機制。

1 研究內容與方法

1.1 消痛湯活性成分的獲取及靶點篩選

利用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)對消痛湯中中藥的全部化學成分進行收集，通過限制口服吸收利用度(OB≥30%)、藥物相似性(DL≥0.18)對中藥的活性成分進行篩選[7]。然后將篩選好的候選活性成分在TCMSP數據庫和SwissTarget Prediction 數據庫(http：//swisstargetprediction.ch/)中收集蛋白靶點。最后通過Uniprot數據庫(https：//www.uniprot.org/)進一步將收集到的蛋白靶點轉化為對應的基因名稱，獲取與活性成分作用相關的蛋白靶點(人源)。

1.2 痛風的靶點篩選

以“gout”“gouty”“Acute Gouty Arthritis”為關鍵詞，在Genecard數據庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https：//omim.org/)、PharmGkb數據庫(https：//www.pharmgkb.org/)、TTD數據庫(http：//db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數據庫(https：//www.drugbank.ca/)中進行檢索，收集痛風的相關基因。

1.3 網絡構建與分析

將獲取到消痛湯活性成分的預測靶點與痛風疾病相關靶點進行Venn(維恩)分析，篩選出“藥物-疾病”的交集基因。應用Cytoscape 3.8.0 軟件構建消痛湯的“成分-靶點”網絡圖，探究消痛湯活性成分和相關靶點的相互作用。然后從Tools工具欄中“NetworkAnalyzer”模塊選擇Analyze Network功能，對藥物進行拓撲分析。在String 數據庫(http：//stringdb.org/)，通過交集得到的靶點構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡。物種設為“Homo sapiens” (人類)，最低相互作用閾值設為最高置信度0.9 “highest confidence”，其余參數保持默認設置。然后把PPI網絡計算出的數據導入Cytoscape 3.8.0 軟件，利用其Apps工具欄中的CytoNCA功能對其進行打分，篩選出核心基因。

1.4 基因本體論(GO)與京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析

應用 R 4.0.2軟件中的BiocManager軟件包對上述交集基因進行GO和KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 活性成分篩選及靶點篩選

本研究中通過TCMSP數據庫獲得消痛湯中杜仲、粉萆薢、白術、百合、防己、金錢草、車前草、威靈仙、土茯苓、黃柏、牡丹皮、伸筋草和甘草13味藥物中的化學成分，通過限定OB≥30%和DL≥0.18進行篩選，共得到234個活性成分，其中杜仲28個、粉萆薢2個、白術7個、百合7個、防己3個、金錢草10個、車前草10個、威靈仙7個、土茯苓15個、黃柏37個、牡丹皮11個、伸筋草5個和甘草92個。剔除未找到靶點的化學成分后，共得到156個，見表1。

表1 消痛湯“中藥-活性成分-預測靶標”信息

2.2 疾病靶點篩選結果

通過Genecard數據庫、PharmGkb數據庫、OMIM數據庫、TTD數據庫和DrugBank數據庫篩選出與痛風疾病相關基因830個。

2.3 網絡構建與結果分析

將所得到的溫膽湯的藥物靶點與痛風疾病相關靶點進行映射，得到146個共有靶點，見圖1。借助Cytoscape 3.8.0軟件構建藥物-靶點網絡，見圖2。對藥物-靶點網絡的拓撲屬性進行分析，篩選出度值與介數均大于平均值的化合物，結果篩選出槲皮素、山柰酚、木樨草素、柚皮素、吳茱萸次堿等15種化合物，提示這些成分可能是消痛湯治療痛風疾病的主要活性成分，見表2。利用String數據庫將映射所得的146個靶點制作成 PPI 網絡，限定其置信度為0.9，其產生相互作用的網絡有142個節點、558條邊，平均節點度：7.86，平均局部聚類系數：0.526，見圖 3。應用Cytoscape軟件的Apps工具欄中的CytoNCA功能對PPI網絡數據進行分析，篩選出12個核心基因，即TNF、IL1B、IL6、IL10、CCL2、CCL5、TIMP1、STAT3、CXCL1、PF4、CXCL8、VEGFA，說明這12個基因可能是消痛湯治療痛風的關鍵靶標，見圖4。

圖1 消痛湯與痛風的共有靶點

注：靶點；○成分。分別代表：1.白術；2.車前草；3.杜仲；4.防己；5.粉萆薢；6.甘草；7.黃柏；8.金錢草；9.牡丹皮；10.伸筋草；11.土茯苓；12.威靈仙

表2 化合物拓撲分析結果

圖 3 消痛湯治療痛風疾病的PPI網絡

圖 4 PPI網絡中的核心基因

2.4 GO和KEGG通路富集分析

應用R軟件的BiocManager軟件包對消痛湯治療痛風的交集基因進行GO分類富集和 KEGG通路富集分析。依據P<0.05 進行GO和KEGG通路富集分析，其中富集靶標越多、P值越小的通路，與消痛湯治療痛風的關系越密切，分別篩選出前10條GO條目和前20條KEGG通路。GO分類富集分析包括細胞組分(cellular component，CC)、生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)3個部分。通過GO分類富集分析確定了2 319個條目，其中涉及生物過程2 160條，主要參與對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、細胞因子產生的正調控、肽基-酪氨酸磷酸化的正調控、肽分泌的調節、細胞對脂多糖的反應、炎癥反應的調節、細胞對細菌來源分子的反應、蛋白質分泌的調節、受體信號通路通過JAK-STAT的正調控等；涉及細胞組分44條，主要包括質膜的外側面、囊腔、分泌顆粒腔、胞質小泡腔、血小板α顆粒管腔、血小板α顆粒、含膠原蛋白的細胞外基質、內質網內腔、MHC蛋白復合物、三級顆粒腔等；涉及分子功能114條，主要包括受體配體活性、信號受體激活劑活性、細胞因子活性、細胞因子受體結合、氧化還原酶活性、類固醇羥化酶活性、生長因子活性、生長因子受體結合、血紅素結合等，見圖5。通過KEGG 通路富集分析，找到了112條信號通路，主要包括風濕性關節炎、細胞因子-細胞因子受體間質、炎癥性腸病、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、結核病、美洲錐蟲病、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、甲型流感、JAK-STAT信號通路、人巨細胞病毒感染、利什曼病、Th17細胞分化、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、弓形蟲病、瘧疾、百日咳、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、阿莫伊比阿斯病、NF-κB信號通路、化學致癌作用、HIF-1信號通路等，見圖6。

圖 5 GO分類富集分析結果

3 討論

本研究篩選出消痛湯與痛風疾病的交集基因有146個，構建出藥物-疾病靶點網絡圖后，通過拓撲分析找出槲皮素、山柰酚、木樨草素等15種主要活性成分。黃嘌呤氧化酶(XOD)是人體內產生尿酸的關鍵酶，其抑制劑可用于治療高尿酸血癥和痛風，研究表明槲皮素對XOD催化的尿酸和超氧陰離子自由基(O2-)的生成有可逆性抑制作用[8-9]。ARSHAD MEHMOOD等[10]研究發現，在黃酮類化合物中木犀草素和黃芩素具有較強的抑制作用，黃酮醇類化合物中山奈酚、槲皮素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷具有抑制作用。尿酸轉運蛋白1(URAT1)是一種生理上重要的腎臟尿酸轉運蛋白，在尿酸鹽重吸收中起重要作用[11]。沈瑞明等[12]研究發現，木犀草素可通過下調TLR/MyD88/NF-κB通路減輕急性痛風性關節炎的炎癥反應。YU TOYODA等[13]研究發現，柚皮素對URAT1具有強烈的抑制作用，能降低尿酸鹽相關疾病的風險。

圖 6 KEGG通路富集分析結果

本研究將146個藥物-疾病交集基因構建出PPI網絡，再根據CytoNCA功能篩選出了IL1B、IL6、TNF等12個核心基因。晶體相關的關節疾病通常與全身炎癥癥狀有關[14]。全基因組關聯研究(GWAS)表明，高尿酸血癥的遺傳基礎是由含尿酸轉運蛋白的基因座主導的，這些轉運蛋白參與了腎臟和腸道排泄尿酸鹽的過程；候選基因研究已經檢測到編碼影響NLRP3(NOD-，LRR-和含吡啶多聚體-3)炎癥體的激活和活性的基因與痛風的關聯[15]。白細胞介素-1β(IL1B)在痛風的炎癥發生過程中起重要作用，并且已知在MSU晶體刺激后，從巨噬細胞中大量釋放[16]。內源性細胞因子IL-6參與MSU介導的NLRP3炎性小體活化和隨后的先天免疫細胞產生IL-1β，并且在MSU晶體誘導的滑膜炎癥中起關鍵作用。腫瘤壞死因子(TNF)在痛風性關節炎的發病機制中發揮著重要作用，其機制包括誘導IL-1活化、增強白細胞介素-6(IL-6)介導的炎癥反應、激活核因子(NF-κB)炎癥信號通路、參與慢性痛風性關節炎的骨骼破壞與侵蝕，以及與中性粒細胞的相互作用[17]。

本研究通過KEGG通路富集分析找到了與痛風密切相關的信號通路，如IL-17信號通路、TNF信號通路、JAK-STAT信號通路、Th17細胞分化、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-kB信號通路、糖尿病并發癥的AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路等。這些通路在痛風的炎癥發生以及代謝性障礙中起重要作用。

本研究運用網絡藥理學方法對消痛湯治療痛風進行了分析，初步揭示了消痛湯治療痛風的潛在活性成分、作用網絡和潛在作用機制，為進一步探討其發揮作用的藥效物質基礎和作用機制提供了研究方向，其后續研究尚需系統的靶點驗證和體內外實驗，以證實其功效網絡的內在關聯和作用靶點集合。