叉頭轉錄因子A2、J2在肝細胞癌組織中的表達及意義

冉小柯，陳欣菊，趙云霞，張 鑫，楊 荷，孫祎堯，陳曉琦

1 河南中醫藥大學 第一臨床醫學院，鄭州 450046；2 河南中醫藥大學第一附屬醫院 消化科，鄭州 450000

原發性肝癌的發病率和病死率均較高，是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因[1-2]，其中肝細胞癌(HCC)約占90%[3]。手術切除、介入、靶向藥物等是目前肝癌治療的常見手段[4-6]，這些傳統的治療方法雖然能夠取得一定療效，但仍然不能有效降低肝癌病死率。因此，探討肝癌發生發展的機制，篩選新的治療方法及靶點，是目前肝癌研究的一個主要方向，對于提高肝癌患者總體預后具有重要的指導意義及臨床應用價值。叉頭(forkhead box，FOX)轉錄因子家族是進化上保守的轉錄因子超家族，其成員是參與轉錄調節和DNA修復的DNA結合蛋白，大多數成員與癌癥有關，FOX家族基因通過基因擴增、逆轉錄病毒整合、染色體易位和轉錄調控參與致癌作用[7-9]，因此，FOX轉錄因子可作為預測和治療的直接或間接靶標，成為新型的監測標志物[10]。其中，FOXA2與FOXJ2是主要發揮抑癌作用的轉錄激活因子[11-12]。本研究通過免疫組化方法檢測FOXA2、FOXJ2在HCC中的表達并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月—2019年7月于河南中醫藥大學第一附屬醫院行手術或穿刺術的原發性肝癌患者54例，其中男44例，女10例，年齡29～78歲，中位年齡56歲，平均(54.85±1.52)歲。所有患者病理學檢查證實為HCC，臨床病理資料完整，均有乙型肝炎病史，未行放療、化療、生物治療等相關治療。參照《原發性肝癌診療規范(2019年版)》[1]進行分期，Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期11例。

1.2 試劑 免疫組化所需FOXA2抗體、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；FOXJ2抗體購自蘇州百遠生物科技有限公司；鼠/兔通用二抗(PV-9000)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 石蠟組織切片需二甲苯脫蠟3次，每次10 min，梯度酒精水化，使用高壓蒸汽鍋進行高溫抗原修復，室溫下濕盒孵育，阻斷內源性過氧化物酶孵育10 min，PBS沖洗3次，FOXA2、FOXJ2抗體均按照1∶100稀釋，滴加一抗后37 °C保溫箱孵育60 min，PBS沖洗3次，滴加適量反應增強液，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，室溫孵育二抗20 min，PBS沖洗3次，加入新鮮配置的DAB 顯色液，室溫孵育5 min，蘇木素復染，脫水透明封片。

1.4 結果判定 FOXA2、FOXJ2免疫組化染色以出現棕黃色或棕褐色為其陽性判定標準，FOXA2主要以細胞核染色為主，FOXJ2細胞核及胞質均染色。所有切片均由本院2名病理科醫師采用雙盲法進行觀察，每張切片隨機觀察計數5個高倍鏡視野下陽性細胞數，根據細胞的染色強度、細胞陽性率和半定量分析進行判定。高倍鏡下隨機選取10個高倍視野(×400)，以陽性細胞所占的百分比聯合細胞的染色強度進行評分。評分標準[13]如下：“-”不表達，計0分，“+”為低表達，計1 ～3分，“++”為中度表達，計4～6分，“+++”為高表達，計7～9分；0分為陰性，1～9分為陽性。

1.5 倫理學審查 本研究經由河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會審核，批號：2018HL-079-01。本研究中樣本信息對外提供或開放使用已在中國人類遺傳資源信息辦公室備案，備案號：2021BAT0182。所有患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 FOXA2、FOXJ2在HCC組織中的表達及相關性分析

FOXA2在HCC組織呈彌漫性胞核表達，FOXJ2呈彌漫性胞核及細胞質表達，染色均呈棕黃色或棕褐色。54例HCC組織中，FOXA2陽性表達38例，陽性表達率約為70.37%(圖1)；FOXJ2陽性表達41例，陽性表達率約為75.92%(圖2)，二者半定量分析均值見表1。HCC組織中FOXA2和FOXJ2表達水平均不服從正態分布，相關性分析采用Spearman秩相關分析，rs=0.648，P<0.001，提示FOXA2與FOXJ2表達水平之間呈顯著正相關。

注：a, FOXA2在HCC組織中不表達；b, FOXA2在HCC組織中低表達；c, FOXA2在HCC組織中中度表達；d, FOXA2在HCC組織中高表達。

表1 FOXA2、FOXJ2表達的半定量分析

注：a, FOXJ2在HCC組織中不表達；b, FOXJ2在HCC組織中低表達；c, FOXJ2在HCC組織中中度表達；d, FOXJ2在HCC組織中高表達。

2.2 HCC組織中FOXA2、FOXJ2的表達與臨床病理特征的關系 FOXA2陽性組與陰性組間腫瘤直徑、分化程度、腫瘤個數、AFP水平比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)；FOXJ2陽性組與陰性組間分化程度比較差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

采用Wilcoxon秩和檢驗對與FOXA2和FOXJ2表達水平相關的病理特征組間差異進行比較，結果提示，FOXA2：腫瘤直徑大小(Z=-0.518，P=0.604)、AFP表達水平高低(Z=-1.386，P=0.166)組間比較差異均無統計學意義，分化程度高低(Z=-2.413，P=0.016)、腫瘤個數多少(Z=-2.113，P=0.035)組間比較差異均有統計學意義；FOXJ2:分化程度高低(Z=-3.423，P=0.001)組間比較差異有統計學意義。

2.3 HCC組織中FOXA2、FOXJ2的表達與預后的關系 對54例HCC患者進行Kaplan-Meier生存曲線分析，結果顯示，FOXA2、FOXJ2陽性表達組HCC患者的累積生存率均顯著高于FOXA2、FOXJ2陰性表達組HCC患者(P值均<0.01)(圖3、4)。

圖3 FOXA2陽性表達及陰性表達HCC患者的生存曲線

圖4 FOXJ2陽性表達及陰性表達HCC患者的生存曲線

3 討論

HCC治療后復發率高，轉移率高，預后差，盡管新型藥品及醫療技術的進步使患者生存狀況較前改善，但仍然無法滿足治療需要[4-6]。目前癌癥的研究主要集中在人類癌癥分子靶向相關治療策略的開發上[14]。過去10年中，分子細胞生物學的進展進一步闡明了癌癥生長、侵襲和轉移的機制，并促進了分子靶向藥物的開發[15]。轉錄調控是基因調控最常見的方式之一，轉錄因子通過結合特定的 DNA 序列來控制從 DNA 到信使 RNA 的遺傳信息轉錄速率，轉錄多種因素包括引發和調節基因轉錄的多種蛋白質[16-17]。FOX家族是進化上保守的轉錄因子超家族，其特點在于獨特的DNA結合叉頭結構域，FOX 結構域是一個約有 100 個氨基酸的單體 DNA 結合結構域，在生物過程中起著調節細胞生長、分化、代謝、增殖、凋亡、遷移、侵襲以及胚胎發生、發育和壽命等多種作用[9,18]。FOX 家族基因作為癌基因或腫瘤抑制基因參與癌癥的發生及發展[7-8]，不同的亞家族其作用機制不同[19]。人類癌癥的全基因組測序數據的快速發展，將揭開FOX家族基因本身及其FOX結合位點在腫瘤細胞上的突變情況，最終將應用于臨床上癌癥的診斷、治療及預后評估[20]。

表2 FOXA2、FOXJ2的表達與肝癌相關臨床病理特征的關系

FOXA2又被稱為肝細胞核因子3-β，是與肝特異性白蛋白相關的轉錄激活因子，FOXA2與染色質相互作用，通過調控基因轉錄和翻譯，參與機體的生長發育及能量代謝[21-23]。同時，FOXA2 也是肝臟發育的先驅因子，具有調節肝臟發育和代謝平衡的作用[24-25]。近年來，有多篇文獻[26-30]報道FOXA2具有抑癌作用，在前列腺癌、子宮內膜癌、肺癌、胃癌、神經膠質瘤等腫瘤細胞中均呈下調趨勢，其表達水平與癌癥惡性程度呈負相關。Wang等[31]對比肝癌組織與癌旁組織中FOXA2表達，發現FOXA2在癌組織中的表達明顯降低，FOXA2 通過抑制基質金屬蛋白酶-9的轉錄和表達，進而抑制HCC的侵襲性和轉移，并影響了上皮細胞-間充質轉化相關蛋白的表達水平。FOXA2的高表達抑制了肝癌細胞增殖，遷移和侵襲的能力，FOXA2可能成為治療HCC的新靶點[32]。本研究結果顯示，FOXA2的表達水平與TNM分期、癌栓形成、是否轉移均無關，這一結論有待擴大樣本量進一步研究；FOXA2的表達水平與腫瘤直徑、分化程度、腫瘤個數、AFP相關，并且與分化程度高低、腫瘤個數多少相關；FOXA2陽性表達組HCC患者的生存時間顯著高于FOXA2陰性表達組，提示FOXA2的表達水平與HCC的發生發展及預后相關，可能是影響肝癌預后的重要基因。

FOXJ2是雙序列特異性結合DNA，有FHX.L和FHX.S(由位于人類染色體上的單個基因編碼)2種同工型[33]，其重要性最近被廣泛關注[34]。FOXJ2目前定位于細胞核中，并且可能參與所有FOX因子的核易位機制[35]，在參與人類早期胚胎發育等諸多過程中發揮重要作用，與調控細胞的生長及代謝以及細胞多種生物學特性關系密切[36]。研究[13,37-39]證實，FOXJ2可抑制鼻咽癌、腦膠質瘤、肺癌、乳腺癌等腫瘤細胞的侵襲和轉移，其表達水平在腫瘤組織中下調，且表達水平降低與腫瘤患者預后不良呈正相關。FOXJ2也可能是肝癌預后的重要因素，Zhang等[40]通過免疫印跡法和免疫組織化學分析表明，FOXJ2 在肝癌組織及肝癌細胞中均下調，并且觀察到 FOXJ2 表達水平與肝癌之間呈負相關，并使用CCK-8分析法證實FOXJ2能夠有效抑制HCC的增殖。本研究結果顯示，FOXJ2的表達水平與HCC的分化程度及分化程度高低相關；FOXJ2陰性表達組HCC患者的生存時間顯著低于FOXJ2陽性表達組患者。由此可見，FOXJ2的表達水平與 HCC 的發生發展及預后關系密切，表明FOXJ2可能是影響HCC患者預后的重要因素。本研究未能發現其與TNM分期、癌栓形成、是否遠處轉移的相關性，可能與本研究樣本量、臨床穿刺及手術患者分期較早等臨床特點相關，有待進一步臨床、基礎研究探討。

靶基因聯合是目前備受關注的熱點，聯合治療可大幅度提高患者獲益率。FOXA2、FOXJ2作為FOX轉錄因子家族成員，通過發揮抑癌作用參與癌癥的發生及發展。本研究結合臨床數據，重點分析FOXA2、FOXJ2 表達水平與臨床相關臨床病理特征及預后的關系，為肝癌治療提供新思路。本研究臨床數據證實，FOXA2和FOXJ2在HCC組織內的表達水平之間呈顯著正相關，表明二者對HCC的影響起協同作用，未來有望共同參與HCC的預測及治療。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：冉小柯負責課題設計，資料分析，撰寫論文；趙云霞、張鑫、楊荷、孫祎堯參與收集數據，修改論文；陳曉琦、陳欣菊負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。