原發(fā)性膽汁性膽管炎肝內(nèi)小膽管上皮細(xì)胞損傷的免疫學(xué)機(jī)制

楊雅斐，鄧志華

山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，太原 030001

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以肝內(nèi)小膽管慢性、進(jìn)行性破壞為特征的自身免疫性疾病[1]。肝臟免疫耐受的打破和免疫系統(tǒng)的異常激活造成肝內(nèi)小膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelial cells，BEC)進(jìn)行性、連鎖性損傷，形成免疫級(jí)聯(lián)破壞反應(yīng)。

1 PBC肝臟免疫耐受的打破

正常情況下，當(dāng)?shù)蜐舛瓤乖M(jìn)入肝內(nèi)，肝內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞如Kupffer細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞通過(guò)下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子的表達(dá)以阻斷抗原的加工和處理，并且下調(diào)共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)、分泌TGFβ促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)的分化來(lái)抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的增殖，從而維持肝臟免疫耐受[2-3]。

PBC的發(fā)生受遺傳和環(huán)境因素影響[1]。全基因組關(guān)聯(lián)研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，位于6號(hào)染色體短臂上的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)等位基因中HLA-DQA1、DQB1、DRB1、DPB1和IL-12A在內(nèi)的40個(gè)非HLA基因是PBC的易感基因位點(diǎn)。PBC的免疫攻擊是針對(duì)一種普遍存在的線粒體抗原，即丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E2亞基(the E2 component of pyruvate dehydrogenase complex,PDC-E2)的脂酰結(jié)構(gòu)域的硫辛酸結(jié)合殘基。帶有PBC易感基因的宿主接觸外界抗原后在體內(nèi)將這些抗原代謝或與自身分子結(jié)合，形成與PDC-E2結(jié)構(gòu)相似的新抗原而導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)激活、肝臟免疫耐受被打破[5-6]。

2 PBC小膽管上皮細(xì)胞的凋亡

肝內(nèi)小膽管的內(nèi)壁由BEC構(gòu)成[6]。當(dāng)大量外源性物質(zhì)(如細(xì)菌脂多糖、食物抗原、化學(xué)品、藥物等)從腸道吸收經(jīng)門靜脈循環(huán)通過(guò)肝內(nèi)小膽管時(shí)，BEC通過(guò)其表面的Toll樣受體主動(dòng)結(jié)合脂多糖等外界抗原，并分泌細(xì)胞因子和趨化因子如IL-6、IL-8、TNFα、CX3CL1等吸引肝內(nèi)外免疫細(xì)胞使自身凋亡[5,7-9]。與其他細(xì)胞不同的是，當(dāng)BEC啟動(dòng)自身凋亡時(shí)，其內(nèi)的谷胱甘肽對(duì)PDC-E2巰基的共價(jià)修飾使PDC-E2抗原表位暴露，引發(fā)B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞相繼激活并靶向攻擊鄰近的BEC；損傷的BEC將PDC-E2轉(zhuǎn)運(yùn)到凋亡小體中，后者被鄰近的正常BEC吞噬，引起一系列針對(duì)BEC的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6-7,10]。

2.1 血清抗線粒體抗體(antimitochondrial antibodies，AMA)的產(chǎn)生 BEC被攻擊后暴露出PDC-E2，激活抗原特異性B淋巴細(xì)胞，后者增殖并分泌IL-6、IFNγ和TNFα促進(jìn)Th1、Th17細(xì)胞增殖分化啟動(dòng)對(duì)其他BEC的損傷，同時(shí)抗原特異性B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生大量AMA[11-12]，凋亡小體中的PDC-E2被AMA識(shí)別并與之結(jié)合為AMA-載脂蛋白復(fù)合物，進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞而引發(fā)周圍的BEC損傷[13]。

2.2 固有免疫細(xì)胞的參與 巨噬細(xì)胞響應(yīng)BEC分泌的趨化因子信號(hào)被募集到肝臟中，AMA-載脂蛋白復(fù)合物刺激巨噬細(xì)胞,后者通過(guò)腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體直接攻擊BEC并產(chǎn)生IL-6、IL-1β、IL-8、IL-12和TNFα，促進(jìn)周邊BEC大量凋亡[13]。此外，巨噬細(xì)胞表達(dá)的炎癥小體NOD樣受體蛋白-3的激活，促進(jìn)炎性因子如IL-18、IL-1β的釋放，進(jìn)而促進(jìn)了BEC的凋亡[7]。

Fu等[14]利用PBC小鼠模型發(fā)現(xiàn)，高濃度脂多糖刺激Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生TNFα和IL-12，這些細(xì)胞因子一方面作用于BEC，另一方面刺激NK產(chǎn)生INFγ介導(dǎo)BEC損傷[14-15]。NK/BEC比值的變化[16]決定NK對(duì)小膽管的損傷程度；將NK與BEC共培養(yǎng)，在NK/BEC低于0.5時(shí)，NK通過(guò)分泌IFNγ促進(jìn)BEC上MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)，NK上的抑制型受體即殺傷免疫球蛋白樣受體(KIR)易與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，抑制NK對(duì)BEC的殺傷活性、保護(hù)BEC免受NK的裂解；在NK/BEC高于0.5時(shí)，BEC表面的MHC-Ⅰ類分子表達(dá)減少或缺失，導(dǎo)致KIR與MHC-Ⅰ類分子的結(jié)合減少，NK對(duì)BEC的保護(hù)作用減弱，同時(shí)NK表面的活化型受體NKG2D與巨噬細(xì)胞表面的MHC-Ⅰ類相關(guān)鏈A結(jié)合，使NK激活并直接攻擊BEC[13-14,16]，導(dǎo)致小膽管的碎裂。在PBC患者的外周血和肝臟中，NK細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增加并靶向攻擊BEC[13]，使BEC損傷并減少，NK/BEC比例失衡引發(fā)持續(xù)的小膽管損傷。此外，BEC通過(guò)向NKT呈遞脂質(zhì)抗原，下調(diào)表達(dá)MHC-I類分子CD1d，導(dǎo)致NKT分泌IFNγ并通過(guò)FasL途徑介導(dǎo)BEC損傷[5,17]。固有免疫細(xì)胞不僅直接參與凋亡BEC的靶向攻擊，還參與損傷周邊正常的BEC并維持持續(xù)的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致了小膽管大量損傷(圖1)。

2.3 CD8+T淋巴細(xì)胞的殺傷啟動(dòng) Zhao等[18]的研究表明，在PBC早期，肝內(nèi)小膽管周圍存在大量PDC-E2特異性的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞。CD8+T淋巴細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞死亡受體Fas結(jié)合BEC上的FasL、釋放穿孔素和顆粒酶這兩種方式來(lái)造成BEC的直接損傷[13,18]。最近，Li等[16]發(fā)現(xiàn)，表達(dá)殺傷細(xì)胞凝集素樣受體G1(KLRG1)的CD8+T淋巴細(xì)胞可分泌大量的穿孔素和顆粒酶，KLRG1+細(xì)胞與血清堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶呈正相關(guān)，這可能是BEC嚴(yán)重?fù)p傷的重要原因。

2.4 CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖分化

受傷的BEC釋放出完整的PDC-E2后，抗原呈遞細(xì)胞一方面通過(guò)MHC-Ⅱ類分子將PDC-E2呈遞給CD4+T淋巴細(xì)胞，另一方面通過(guò)CD80和CD86共同刺激T淋巴細(xì)胞的CD28受體使CD4+T淋巴細(xì)胞分化為Th1、Th17細(xì)胞(圖1)，進(jìn)一步參與BEC損傷[13]。

2.4.1 Th1細(xì)胞對(duì)BEC損傷早期的主導(dǎo)作用 PBC患者中，除了巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞以外，CD19+CD24hiCD38hiBreg細(xì)胞也產(chǎn)生大量IL-12[19]；IL-12與CD4+T淋巴細(xì)胞表面IL-12受體結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄激活蛋白4(signal transducer and activator of transcription 4, STAT4)的酪氨酸和絲氨酸磷酸化,誘導(dǎo)STAT4移動(dòng)至Th1細(xì)胞的細(xì)胞核并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子ERM從而激活Th1細(xì)胞[20-21]；激活后的Th1細(xì)胞分泌IFNγ導(dǎo)致大量BEC損傷；IFNγ是導(dǎo)致小膽管損傷的關(guān)鍵因素，在PBC基因易感宿主中上調(diào)IFNγ的表達(dá)可使肝臟免疫耐受喪失，IFNγ還能激活巨噬細(xì)胞向“M1”型轉(zhuǎn)變，使其產(chǎn)生大量IL-12、IL-23和TNFγ等促炎性細(xì)胞因子，正反饋促進(jìn)Th1細(xì)胞反應(yīng)[22]。在PBC早期，IL-12/Th1型細(xì)胞因子在小膽管周圍占主導(dǎo)地位，且肝內(nèi)Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞處于相對(duì)平衡狀態(tài)，當(dāng)疾病向晚期進(jìn)展時(shí)，Th1/Th17平衡向Th17偏移[22]。

2.4.2 Th17細(xì)胞對(duì)BEC損傷進(jìn)展的促進(jìn)作用 受到外界抗原持續(xù)刺激的BEC可產(chǎn)生大量IL-6、IL-1β和IL-23等細(xì)胞因子；CD4+T淋巴細(xì)胞在TGFβ和IL-6共同存在時(shí)促進(jìn)視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt的表達(dá)并分化為Th17細(xì)胞。Th17細(xì)胞分泌IL-17與BEC表面的IL-17受體結(jié)合促進(jìn)BEC產(chǎn)生更多的IL-6、IL-1β和IL-23，從而使Th17細(xì)胞不斷產(chǎn)生與成熟[23-24]。Sun等[25]發(fā)現(xiàn)，PBC患者外周血IL-17水平明顯高于正常人，且與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平呈正相關(guān)。IL-17誘導(dǎo)BEC產(chǎn)生趨化因子如CXCL2、CXCL6和CCL20來(lái)吸引Th1、Th17細(xì)胞向BEC周圍聚集并損傷BEC。PBC早期患者的外周血中Th17細(xì)胞比例明顯高于晚期患者，但PBC晚期患者的肝內(nèi)Th17細(xì)胞比例高于早期患者[7,24]。以上說(shuō)明，晚期小膽管的損傷主要以Th17為主，且Th17及產(chǎn)生的IL-17促進(jìn)疾病向晚期發(fā)展,與PBC預(yù)后有關(guān)。因此，靶向IL-17的免疫治療可能有助于改善PBC的病情及預(yù)后。

2.4.3 Treg細(xì)胞減少對(duì)BEC損傷的間接促進(jìn)作用 當(dāng)不存在促炎性因子時(shí)，TGFβ可促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞分化為CD4+CD25+Foxp3+Treg[24]。Chen等[26]發(fā)現(xiàn)，PBC患者的Treg數(shù)量及其產(chǎn)生的IL-10水平相比正常對(duì)照組明顯下降。Liaskou等[27]的研究表示，與正常對(duì)照組相比，PBC患者的Treg對(duì)低水平的IL-12敏感，并表達(dá)較高水平的IL-12受體β2與IL-12結(jié)合，促使STAT4磷酸化進(jìn)而促進(jìn)Treg轉(zhuǎn)化為Th1細(xì)胞，導(dǎo)致Treg減少。Treg產(chǎn)生減少并被誘導(dǎo)凋亡或轉(zhuǎn)化為其他類型細(xì)胞，使其無(wú)法有效抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞增殖與分化，從而間接促進(jìn)了小膽管的損傷。

體外擴(kuò)增Treg的細(xì)胞療法可用于治療自身免疫性疾病。近年來(lái)，利用基因工程技術(shù)在Treg中表達(dá)嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)已經(jīng)在各種動(dòng)物疾病模型研究中有所收獲。CAR-Treg可遷移到具有特定抗原的靶器官，通過(guò)分泌穿孔素和顆粒酶以及FasL途徑來(lái)誘導(dǎo)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞凋亡，并且CAR-Treg上的CTLA-4與T淋巴細(xì)胞的CD28競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞上的CD80/CD86抑制效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活化[28]。目前CAR-Treg細(xì)胞療法對(duì)PBC患者的療效尚未清楚。

圖1 免疫系統(tǒng)對(duì)BEC的作用

3 小結(jié)

肝臟免疫耐受喪失是PBC發(fā)生發(fā)展的重要原因，免疫系統(tǒng)異常激活造成肝內(nèi)小膽管上皮細(xì)胞損傷，其中涉及的免疫反應(yīng)包括以巨噬細(xì)胞、NK、NKT細(xì)胞為主的固有免疫反應(yīng)和以Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞為主的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。近40年來(lái)，熊去氧膽酸作為唯一被批準(zhǔn)的抗膽汁淤積藥一直主導(dǎo)著治療，但仍有部分PBC患者對(duì)熊去氧膽酸治療反應(yīng)欠佳。PBC免疫靶向治療的有效藥物尚未出現(xiàn)。因此，明確PBC發(fā)生發(fā)展的免疫學(xué)機(jī)制將有助于為PBC的診斷、疾病的監(jiān)測(cè)、新藥的制備提供新的思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊雅斐負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，查閱文獻(xiàn)，撰寫文章；鄧志華負(fù)責(zé)指導(dǎo)、修改文章。