切割小鼠X染色體的CRISPR/Cas9系統表達載體的構建及驗證

謝紹怡 蔣璐蔓 楊曉峰 張仙玉 吳珍芳 李紫聰

（華南農業大學動物科學學院 國家生豬種業工程技術研究中心，廣州 510642）

性別控制即利用人為手段，控制動物后代性別比例向人們所希望的方向偏移［1］。實現性別控制可以有效減少畜牧生產上原材料的浪費，提高經濟效益；同時，對于拯救瀕危動物、減少伴性遺傳疾病的發生等具有重要意義。

在自然繁殖條件下，孟德爾分離定律決定動物后代性別比例為1∶1，而其外部環境的改變則影響著動物實際性別比圍繞著1∶1的比例上下波動［2］。由于環境因素對性別決定的作用機制尚未明確，關于這方面的性控研究均存在著重復性差、性別偏移程度較低的問題［3-5］。相反，在人為控制后代的遺傳物質方面，卻能取得了很好的性控效果，如流式細胞儀分選X/Y精子技術。它是使用Hoechst33342染料結合精子DNA，利用了X/Y精子DNA含量的差異，識別其結合染料的熒光強度，從而對精液進行分選。研究表明，適當濃度的Hoechst33342染料對精子活力等不會造成顯著影響［6］，且使用分選后的精液進行人工授精其懷孕率、產犢數、初生重等與普通精液相比無顯著差別［7］。目前最新的流式細胞儀每秒可以分離8 000個精子，其X精子的分離純度可達到90%以上，Y精子純度可達到85%以上［8］。然而，流式細胞儀價格昂貴，技術要求高，且其分選速率很難滿足豬等單次輸精量很大的動物人工輸精量的要求，故該技術現今主要應用于牛、羊業的生產上，難以在其他動物上推廣應用。

近年，Galizi等［9-10］在蚊子上作出了一項創新性的性控研究，其通過轉基因的方式在雄性減數分裂后期特異性切割X染色體，阻止X精子的形成，使后代中雄性的比例平均能夠達到90%以上。該研究成功的關鍵在于：分別構建的內切核酸酶I-PpoI和CRISPR/Cas9系統的表達載體，這些載體可以切割僅在X染色體上發現的核糖體DNA（rDNA）重復序列內的保守序列，并最終能夠達到X染色體整體失活的效果。遺憾的是，哺乳動物體內并不存在類似的核酸酶和rDNA序列。然而，CRISPR/Cas9系統作為目前較為成熟的一種基因編輯工具，在靶位點的選擇上具有很高的靈活性，是代替內切核酸酶I-PpoI的一個理想選擇。根據上述研究思路，我們可以利用CRISPR/Cas9系統，在不同動物上設計多個靶向性染色體上的sgRNA，刪除一條性染色體，以減少某一性別的精子或胚胎，在哺乳動物上實現性別控制。

本研究設計并構建了靶向小鼠X染色體的CRISPR/Cas9系統表達載體，在體外、細胞及胚胎水平驗證其切割效果，為制備只生產Y精子的轉基因小鼠及小鼠胚胎注射提供載體基礎，為進一步利用基因編輯技術控制大型哺乳動物后代性別比例的相關研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的pKMV質粒由華大基因合成提供；載體一為楊曉峰構建并由本實驗室保存［11］；MLTC-1細胞購自中科院上海細胞庫；C57BL/6雌鼠由廣東省醫學實驗動物中心提供。

限制性內切酶FseI購自NEB公司，MluI購自TaKaRa公司；T4連接酶購自賽默飛公司。去內毒質粒小提試劑盒E.Z.N.ATMEndoFree Plasmid Mini Kit；sgRNA 體外轉錄試劑盒 Gene ArtTMPrecision gRNA Synthesis Kit、Cas9 蛋白和熒光定量試劑 Power SYBRTMGreen Master Mix購 自 Life公 司；DL2000、DL10000 DNA Marker，6×DNA Loading Buffer，2×RNA Loading Buffer 購自北京全式金生物技術有限公司；RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）、0.25%Trypsin、DPBS均購自Gibico公司。

1.2 方法

1.2.1 靶位點的選擇及其對應sgRNA的設計 對小鼠的X染色體進行深度測序，挑選出其中拷貝數多于50的重復序列備用。然后利用CRISPR/Cas9靶序列在線設計軟件分析備選序列，并在NCBI基因庫中與小鼠的全基因組序列進行比對，選擇合適的靶位點及其sgRNA。

1.2.2 CRISPR/Cas9系統共表達載體的構建 根據所選擇的sgRNA序列，設計具有如下結構的序列：MluI-loxP-U6 promoter-sgRNA X1-U6 promoter-sgRNA X3-loxP2272-FseI。由深圳華大基因公司合成對應的基因片段，并利用MluI和FseI雙酶切的方法將上述基因片段連接到載體pKMV中，即得sgRNA片段合成質粒。分別取1 μg的載體一（本課題組保存）和sgRNA片段合成質粒，利用MluI和FseI兩種酶進行雙酶切。然后將酶切后的載體和目的片段回收，使用T4連接酶在22℃環境中連接1 h。最后經轉化、涂板，挑取單克隆操作后，交由華大基因公司進行測序驗證。構建好的CRISPR/Cas9系統共表達載體命名為CMV載體。

1.2.3 sgRNA X1和sgRNA X3體外轉錄及體外切割驗證 根據靶位點X1和X3的核苷酸序列分別對應設計引物，以MLTC-1細胞的DNA為模板，通過PCR擴增，得到靶片段X1和靶片段X3，PCR引物如表1所示。同時將構建好的CMV載體菌液擴大培養后抽提質粒，用該質粒作為模板，使用表2中的引物進行PCR擴增，得到sgRNA X1體外轉錄模板和sgRNA X3體外轉錄模板。使用GeneArtTMPrecision gRNA Synthesis Kit（Life）試劑盒獲得體外轉錄的sgRNA X1和sgRNA X3。

隨后進行體外切割驗證。配制反應體系：體外轉 錄 的 sgRNA 50 ng，Cas9 enzyme 1 μL，10×Cas9 Reaction buffer 2 μL，Nuclease-free water 15 μL。將配制好的反應體系混合均勻，于37℃金屬浴放置15 min后，加入相應的靶片段，輕輕吹打混勻后，繼續孵育1 h；最后在反應體系中加入2 μL蛋白酶K再次孵育20 min；結束反應后將全部的反應產物進行2%瓊脂糖電泳，以等量（100 ng）的質粒做對照，使用凝膠成像系統分析其體外切割結果。

表1 靶片段擴增引物Table 1 Target fragment amplification primers

1.2.4 MLTC-1細胞培養及轉染 MLTC-1細胞（購自中科院上海細胞庫）的完全培養基為RPMI 1640培養基加12% FBS，培養條件為37℃，5% CO2。細胞轉染是使用LONZA Amaxa Nucleofector2b細胞電轉儀進行電轉染，電轉程序為U-023，質粒用量為15 μg每孔。轉染完成后將細胞懸液轉移培養基中，并均勻分到六孔板中培養，6 h后換液，去除未貼壁的死細胞。

表2 sgRNA體外轉錄模板擴增引物Table 2 Primers for amplification of sgRNA transcription template in vitro

1.2.5 MLTC-1細胞轉染CMV載體致死效率的檢測 實驗以MLTC-1細胞轉染CMV載體為實驗組，轉染空載體組為對照組。以12 h為間隔，使用倒置顯微鏡觀察兩組細胞，并對不同時間段的細胞使用白光和熒光兩種模式拍照記錄。在熒光拍照后收集細胞：首先用0.25%的胰酶消化六孔板細胞1 min，然后用移液器輕輕吹落細胞并轉移至15 mL的離心管中，經800 r/min離心5 min后，棄上清，保留細胞沉淀。最后使用流式細胞儀進一步計算熒光細胞的比例。

1.2.6 CMV載體對雄性小鼠細胞的X1靶位點突變效率的檢測 根據實驗方法1.2.4中的細胞轉染方法用CMV載體轉染雄性小鼠細胞MLTC-1，將轉染后的細胞懸液稀釋到合適濃度，均勻鋪在10 cm細胞培養皿中培養數天，待到一個細胞團在顯微鏡40×倍視野中細胞個數約為6個且周圍無雜細胞時挑取單克隆細胞團，將其轉移至48孔板中培養，而后依據細胞生長情況依次傳代至12孔板、6孔板、6 cm細胞培養皿中，待細胞長滿6 cm培養皿時，收集細胞提取DNA。PCR擴增X1的部分靶位點序列，引物如表3所示。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，純化后進行TA克隆，將X1的靶位點片段克隆到pEASY-T5 Zero克隆載體中；經大腸桿菌感受態轉化后，獲得的菌液送華大基因公司使用通用引物M13進行測序；將測序結果與靶片段的理論序列進行比對，尋找突變位點，統計突變效率。

表3 X1靶位點擴增引物Table 3 Primers for amplification of the X1 target site

1.2.7 注射CMV載體對小鼠孤雌胚胎體外發育的影響 選取6周齡左右性成熟的C57BL/6雌鼠，腹腔內注射5 IU的孕馬血清促性腺激（PMSG），48 h后使用5 IU的人絨毛膜促性腺激素（hCG）對同一小鼠再次進行腹腔注射，注射完成12 h后雌鼠便可誘發超數排卵。處死超數排卵的雌鼠，收集其卵母細胞，用含有5 μm/mL CB的10 mmol/L的SrCl2激活液處理2 h，接著繼續培養3-4 h后觀察細胞是否被成功激活。采用無內毒素質粒小提試劑盒抽提空載體質粒和CMV載體質粒，稀釋至15 ng/μL備用。然后，將激活成功的孤雌胚胎分為兩組，將稀釋好的質粒分別注射入孤雌胚的原核內。注射空載體的為對照組，注射CMV載體的為實驗組。最后，將注射后的孤雌胚胎培養至囊胚，分別計數兩組孤雌胚胎發生卵裂的和發育到囊胚的比例。同時，分別取部分囊胚用染料Hoechst33342進行染色，拍照并記錄每個囊胚的細胞數。

2 結果

2.1 靶向小鼠X染色體多拷貝基因的sgRNA設計

根據在線軟件的分析結果，結合最小脫靶效率，本實驗選擇了兩個多拷貝基因X1和X3作為靶位點，其對應的sgRNA具體信息如表4。

表4 靶向小鼠X染色體多拷貝基因的sgRNA序列Table 4 Sequences of sgRNA targeting mouse X chromosome multi-copy genes

2.2 靶向小鼠X染色體多拷貝基因的sgRNA和Cas9蛋白共表達載體的構建

實驗將載體一中sgRNA相關元件序列替換成可以表達靶向小鼠X染色體上X1、X3位點的sgRNA序列，構建了靶向小鼠X染色體多拷貝基因的sgRNA和Cas9蛋白共表達載體，即CMV載體，其構建示意圖詳見圖1-A所示。載體一與sgRNA片段合成質粒雙酶切的結果見圖1-B。

2.3 sgRNA X1和sgRNA X3介導Cas9蛋白在體外切割靶序列的效率驗證

sgRNA體外切割驗證結果如圖2所示。將成像結果進行灰度分析，結果顯示sgRNA X1和sgRNA X3分別介導的Cas9蛋白對其靶序列的切割效率分別為60.0%和75.0%，表明兩個sgRNA介導的CRISPR/Cas9系統均具有較高的切割效率。

2.4 CMV載體轉染后對MLTC-1細胞致死效率的檢測

MLTC-1細胞為小鼠雄性細胞，基因型為XY，如果切割并刪除X染色體，變成OY型細胞，則不能存活。MTLC-1細胞分別轉染CMV載體與空載體后不同時間點于顯微鏡下觀察細胞變化（圖3-A），結果顯示在轉染后48 h內兩組的綠色熒光細胞數量均逐漸增加，而后實驗組的熒光細胞數則大量減少。為了能夠更直觀的展現綠色熒光細胞比例的變化，用流式細胞儀精確計算兩組熒光細胞的比例（圖3-B），結果顯示兩組的綠色熒光細胞比例均在轉染后約48 h達到最大值，到轉染后60 h，轉染CMV載體的實驗組綠色熒光細胞比例下降37.5%，轉染空載體的對照組綠色熒光細胞比例僅下降1.5%，兩組對比差異顯著。該結果說明了在成功轉染CMV載體后，大部分細胞因其中X染色體被刪除而死亡。

2.5 CMV載體轉染后對MLTC-1細胞的X1靶位點突變效率的檢測

基于基因組的自我修復機制，CMV載體即使對轉染后的MLTC-1細胞X染色體進行了切割，有一部分細胞也可能成功自我修復而存活下來，但這部分細胞的基因很可能在靶位點附近形成突變。CMV載體轉染MLTC-1細胞后共挑取192個單克隆細胞團，檢測了其中36個克隆細胞的突變情況。其中4個單克隆細胞團尋找到突變位點，測序比對結果如圖4所示。結果表明，CMV載體對雄性小鼠細胞X1靶位點的突變效率約為11.1%，突變類型以點突變為主。

圖1 CMV載體的構建及鑒定Fig.1 Construction and identification of CMV vector

圖2 sgRNA X1和sgRNA X3介導Cas9蛋白在體外切割靶序列效率驗證的電泳圖Fig.2 Electrophoresis diagram of verifying the efficiency of sgRNA X1 and sgRNA X3 mediated Cas9 protein cleaving target sequence in vitro

2.6 小鼠孤雌胚胎注射CMV載體后對其卵裂率、囊胚率及囊胚細胞數的影響

小鼠孤雌胚胎注射CMV載體組和注射空載體組的卵裂胚數、囊胚數統計結果見表5，結果顯示兩組的卵裂率沒有顯著差異。注射CMV載體組的囊胚率低于注射空載體組的囊胚率，但兩組差異不顯著。然而，囊胚染色的結果顯示，注射CMV載體組平均囊胚細胞數為33.93個，注射空載體組平均囊胚細胞數為44.66個，兩組的囊胚細胞數差異達到顯著水平（P＜0.01）。這表明在部分囊胚細胞中實現了Cas9對細胞X染色體的切割和刪除，并且造成了部分細胞的死亡，從而使得注射CMV載體組和注射空載體組囊胚細胞數出現差異。

3 討論

CRISPR/Cas9技術是現今最為熱門的基因編輯技術，可以實現基因敲除、基因沉默、基因敲入以及各種目的的基因編輯，且具有高效的切割效率，已被廣泛應用于多個物種的基因組研究中。研究表明，CRISPR的切割效率在某些物種中可高達80%以上［12］。但是，該效率同時也會受到許多因素的影響，如sgRNA的GC含量、sgRNA與Cas9蛋白的表達劑量與表達模式、SSA報告載體的應用、切割環境（體內、體外）等［13-15］。本實驗構建的CMV載體為共表達載體，其體外切割實驗結果顯示sgRNA X1和sgRNA X3介導的Cas9蛋白切割靶序列的效率分別為60.0%和75.0%，表明了兩個sgRNA在體外介導的CRISPR/Cas9系統均具有較高的切割效率。

圖3 CMV載體、空載體轉染MLTC-1細胞不同時間的熒光細胞數比較結果Fig.3 Comparison results of the number of fluorescent cells in MLTC-1 cells at different time after transfecting with CMV vector and empty vector

Zuo等［16］采用具有兩種基因型的小鼠胚胎干細胞進行染色體刪除實驗，獲得了X染色體缺失的小鼠。但是其使用了DNA FISH和WGS兩種方法進行檢驗，過程復雜且技術要求較高。為了方便檢測細胞內X染色體是否被刪除，我們采用小鼠睪丸間作用可致使X染色體整體失活，最終導致細胞死亡。

圖4 CMV載體轉染后對MLTC-1細胞的單克隆細胞團X1靶位點處測序結果Fig.4 Sequencing results of the X1 target site of the monoclonal cell mass of MLTC-1 cells after CMV vector transfection

哺乳動物細胞對CRISPR系統造成的雙鏈斷裂具有一定的修復作用，其中主要的修復方式為非同源末端連接［17-18］，這種修復方式的錯誤率較高，會導致染色體缺失、插入和點突變等頻率增加［19］。本實驗對轉染CMV載體后的MLTC-1細胞進行X1靶位點的突變效率檢測，間接驗證CMV載體在細胞水平上的切割效率。實驗結果進一步證實了CMV載體可以刪除雄性細胞內X染色體的推斷。同樣地，有研究構建了靶向小鼠Y染色體上Rbmy基因的CRISPR/Cas9系統表達載體，成功刪除了Y染色體，且其在細胞內對Rbmy基因的突變效率為15.4%［20］。然而，本實驗設計的CMV載體對X1靶位點的突變效率只有11.1%，可能是由于部分細胞的X染色體被切割后失活，細胞死亡，無法檢測突變率。另外，由于X3基因在X染色體上分布十分分散，實驗僅檢測了CMV載體對X1靶位點的突變率，未檢測CMV載體對X3靶位點的突變率，因此CMV載體對轉染后的細胞X染色體整體的實際突變效率很有可質瘤細胞MLTC-1進行實驗，其基因型全為XY型，X染色體被刪除后，細胞即死亡。實驗結果顯示，CMV載體成功轉染MLTC-1細胞后，細胞死亡率顯著提高。據此可以推斷CMV載體對X染色體的切割能是高于11.1%的。

表6 CMV載體和空載體注射孤雌胚體外發育效率比較Table 6 Comparison of in vitro development efficiency of parthenogenetic embryos injected with CMV vector and empty vector

實驗用CMV載體和空載體質粒分別注射小鼠的孤雌胚胎，注射CMV載體組的囊胚率為58.1%，注射空載體組的囊胚率為69.5%。兩組對比分析，實驗組的囊胚率雖然低于對照組，但并未達到顯著水平，這可能與注射質粒在胚胎中的表達水平有關。胚胎內的基因表達需要經歷合子基因組激活過程，即從母型調控向配型調控的，然后胚胎開始自行轉錄、翻譯合成蛋白質［21］。合子基因組激活過程通常發生在二細胞期到四細胞期，注射的質粒不能第一時間表達而發揮切割作用；同時因為細胞分裂注射的質粒被稀釋，部分卵裂球中sgRNA和Cas9基因無法表達或者表達水平極低而不足以實現切割作用，無法導致胚胎死亡。本研究通過檢測部分囊胚的細胞數發現，注射CMV載體組的囊胚細胞數顯著低于注射空載體組，這一結果從側面證實前述的猜想。另一方面，小鼠孤雌胚胎存在多種不同的激活類型，不僅存在單倍體、二倍體，甚至可能存在四倍體［22］。四倍體胚胎中存在多條X染色體，即使CMV載體發揮了切割作用，但無法完全刪除所有的X染色體，胚胎仍然有可能存活，所以注射CMV載體組和注射空載體組的囊胚率沒有顯著性差異。

本研究結果表明，CMV載體可以對小鼠的X染色體進行有效切割。后續實驗可以結合超數排卵技術，顯微注射CMV載體至小鼠胚胎，致死雄性胎兒，以獲得更多的雌性后代；此外，也可以用于制作轉基因公鼠，通過控制載體的作用時間，使其只生產Y精子，從而提高后代雄性比例。

4 結論

本研究設計了兩個靶向小鼠X染色體上多拷貝基因的sgRNA，構建了切割X染色體的CRISPR/Cas9表達載體：CMV載體，通過體外切割實驗、細胞轉染實驗和孤雌胚胎注射實驗證實了該載體在體外、細胞和胚胎水平上均具有較高的切割效率，可以成功刪除X染色體。