溶藻弧菌PEPCK蛋白原核表達(dá)及其乙酰化、琥珀酰化修飾的鑒定

曾福源 蘇澤輝 周詩慧 謝妙 龐歡瑛

（1.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，深圳 510000；2.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害控制重點實驗室，湛江 524088）

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）作為糖異生過程中的一個關(guān)鍵代謝酶，催化草酰乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖岷投趸迹菐缀跛猩矬w糖異生中所必須的［1-2］。根據(jù)草酰乙酸無機(jī)磷酸鹽供體的來源，PEPCK可分成ATP依賴性、GTP依賴性和PPi（inorganic pyrophosphate，PPi）依賴性 3 種類型［3-5］。該酶參與的代謝過程，在生物體血糖水平［6］、毒力調(diào)控［7］、抗病毒［8］。等方面均具有十分重要的作用，在不同生物的碳代謝中也具有不同的生理作用［9］。此外，還能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，是一種很好的疫苗候選分子［10-11］。

蛋白質(zhì)乙酰化是一種常見的翻譯后修飾方式，參與轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、趨化作用、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個生物學(xué)過程，并發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用［12］。乙酰化通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)代謝酶活力，對代謝具有廣泛的調(diào)控功能［13］。乙酰化修飾代謝酶可對糖酵解和糖異生代謝方向進(jìn)行調(diào)控，如增加GapA（磷酸脫氫酶）的乙酰化程度可以增強(qiáng)菌體糖酵解活性，同時降低葡萄糖新生的能力［14］。在鼠傷寒沙門菌中，蛋白質(zhì)乙酰化修飾參與了細(xì)菌毒力的調(diào)控及其體外誘導(dǎo)株耐藥性的產(chǎn)生［15-16］。

蛋白質(zhì)賴氨酸琥珀酰化是琥珀酰基供體通過酶學(xué)或非酶學(xué)的方式將琥珀酰基團(tuán)共價結(jié)合到賴氨酸殘基的過程［17］，是近年來頗受關(guān)注的一種翻譯后修飾。琥珀酰化和乙酰化通常具有較多的重疊位點，與乙酰化修飾相比，琥珀酰化修飾更能促進(jìn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化［18］。琥珀酰化修飾廣泛存在于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中［19-20］，參與糖酵解、三羧酸循環(huán)、電子傳遞鏈等多種細(xì)胞代謝過程中關(guān)鍵酶活性的調(diào)控［21］。在結(jié)核分枝桿菌琥珀酰化修飾組學(xué)圖譜中，許多代謝酶及抗生素耐藥相關(guān)蛋白發(fā)生了琥珀酰化修飾［22］。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是隸屬于弧菌科弧菌屬的嗜鹽嗜溫性革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于海洋、河口、海水養(yǎng)殖池等水體環(huán)境中［23］，是魚、蝦、貝類的主要病原菌，給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［24-26］。免疫蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)PEPCK蛋白具有免疫原性，為溶藻弧菌、哈維氏弧菌及副溶血性弧菌的交叉免疫原蛋白，是亞單位疫苗的候選抗原［27］。此外，PEPCK與溶藻弧菌的耐藥性密切相關(guān)［28］。最近報道的弧菌乙酰化、琥珀酰化修飾組學(xué)圖譜中也發(fā)現(xiàn)了PEPCK，但其修飾特性尚未得到驗證［29-30］。本研究通過構(gòu)建溶藻弧菌PEPCK蛋白的原核表達(dá)載體，優(yōu)化其表達(dá)條件，并對其乙酰化及琥珀酰化修飾進(jìn)行鑒定，旨為進(jìn)一步探究PEPCK的乙酰化和琥珀酰化修飾對溶藻弧菌的毒力及耐藥性的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

溶藻弧菌HY9901、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）和表達(dá)載體pET-28a均由本實驗室保存。T4 DNA連接酶、EcoR I和Xho I限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組抽提試劑盒、核酸切膠回收試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司；異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；鼠抗乙酰化賴氨酸抗體（antiacetyllysine mouse mAb（clone Kac-01），#PTM-101）、鼠抗琥珀酰化賴氨酸抗體（anti-succinyllysine mouse mAb（clone 3D3），PTM-419）購自杭州景杰生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG（H+L，#A0216）和His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)BeyoGold His-tag Purification Resin（耐變性劑型）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL顯色液（ClarityTMWestern ECL Substrate）購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 pepck基因的克隆 將HY9901菌株加入100 mL TSB培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600nm達(dá)0.8時，使用細(xì)菌基因提取試劑盒，按說明書提溶藻弧菌HY9901的DNA。根據(jù)GenBank上溶藻弧菌pepck基因序列（No：MT683849）設(shè)計分別含EcoR I和Xho I酶切位點的正反鏈引物，正鏈引物F：CCGGAATTCATGACCGTTATGGAACAT（下劃線為EcoRI酶切位點），反鏈引物R：CCGCTCGAGATCAATCTGAGGACCAGC（下劃線為XhoI酶切位點）。以溶藻弧菌HY9901的DNA為模板鏈擴(kuò)增pepck基因，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，33個循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，按照DNA凝膠回收試劑盒的說明進(jìn)行純化。

1.2.2 pET-28a-pepck表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明提取pET-28a質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和XhoI酶切，用T4DNA連接酶將切膠回收的產(chǎn)物與酶切后的pET-28a置于4℃冰箱中連接過夜。連接成功后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)無抗性的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后涂布于LB平板（含Kana 100 μg/mL），挑取單菌落，接種于 800 μL LB（含 Kana 100 μg/mL）培養(yǎng)基中，于37℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜，進(jìn)行菌液PCR鑒定。鑒定引物序列為F：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG，R：TAATACGACTCACTATAGGG。挑取陽性菌液送至生工測序。

1.2.3 PEPCK蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 按體積比1∶100的比例，將含pET-28a-pepck重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）接種于 LB（含 Kana 100 μg/mL）培養(yǎng)液中，于37℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.4-0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，于37℃條件下200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h。取1 mL培養(yǎng)物，12 000×g室溫離心2 min，棄上清，用1 mL PBS洗滌兩遍。加入 50 μL PBS和 10 μL 6× 蛋白上樣緩沖液重懸菌體，水煮法提取細(xì)菌蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析。對照組為IPTG的pET-28a、不含IPTG的pET-28a、pET-28a-pepck，處理方法與實驗組一致。

1.2.4 PEPCK蛋白表達(dá)條件優(yōu)化 采用控制變量法，對不同溫度、IPTG濃度和時間條件下重組菌株的PEPCK蛋白表達(dá)效果進(jìn)行比較。當(dāng)OD600nm達(dá)0.4-0.6時開始誘導(dǎo)。

溫度：設(shè)置28℃和37℃兩個溫度，在IPTG濃度為0.2 mmol/L條件下振蕩培養(yǎng)10 h，收集10 mL菌液，4℃ 6 000 r/min離心30 min，棄上清，用6 mL的PBS吹勻、洗滌兩遍后懸浮菌體。置于冰水混合物中超聲波破碎重組細(xì)菌，破碎程序設(shè)置為：功率300 W，超聲開時間5 s，超聲關(guān)時間8 s，超聲破碎10 min至菌液清澈透亮即可。離心、分裝上清和沉淀，沉淀用8 mol/L尿素在4℃條件下浸泡過夜，各取50 μL并分別加入10 μL 6× 蛋白質(zhì)上樣緩沖液，充分混勻后以10 μL/孔的上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色、脫色液（40%乙醇，10%冰醋酸，50%雙蒸水）脫色，最后使用Gel-pro Analyzer分析結(jié)果。

IPTG濃度：在28℃，誘導(dǎo)時間為10 h的條件下，IPTG濃度設(shè)置為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。菌液收集、處理及分析如1.2.3的步驟。

時間：在28℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L的條件下，誘導(dǎo)時間設(shè)置為0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、和10 h。菌液收集、處理及分析如1.2.3的步驟。

1.2.5 His-PEPCK蛋白的純化 經(jīng)最優(yōu)誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)后，收集菌液、提取蛋白，采用His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)過柱純化。將蛋白與填料在4℃條件下孵育過夜，隨后加入純化柱中，按碧云天公司的His標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)使用說明書操作。

1.2.6 Western blot驗證PEPCK蛋白的乙酰化及琥珀酰化 取純化后的PEPCK蛋白，加入Loadind Buffer混勻，取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE，電泳條件：5%濃縮膠，80 V 30 min；10%分離膠，120 V 90 min。使用轉(zhuǎn)印儀將PEPCK蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，條件為：200 mA，90 min。加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液，置于4℃冰箱封閉過夜，TBST漂洗4次，每次10 min。分別加入2 μL景杰生物科技有限公司的鼠抗乙酰化賴氨酸抗體和鼠抗琥珀酰化賴氨酸抗體（1∶5 000），37℃孵育2 h，TBST漂洗4次，每次10 min。加入1 μL碧云天生物技術(shù)有限公司的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000），37℃孵育2 h，TBST漂洗4次，每次10 min。經(jīng)ECL顯色液顯色后，使用全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（TAN 5200）拍照、記錄實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pepck基因的克隆

挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)凝膠電泳檢測條帶大小約1 629 bp（圖1），與pepck ORF大小一致，表明pepck基因克隆成功。

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-pepck的構(gòu)建

pepck基因片段與pET-28a質(zhì)粒成功重組后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果獲得1 989 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。經(jīng)測序未發(fā)現(xiàn)pepck有錯配或突變，證明原核表達(dá)載體pET-28a-pepck構(gòu)建成功。

圖1 pepck基因的克隆Fig.1 Cloning of pepck gene

圖2 構(gòu)建pET-28a-pepck載體Fig.2 Construction of pET-28a-pepck vector

2.3 誘導(dǎo)PEPCK蛋白表達(dá)

成功構(gòu)建的重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可表達(dá)相對分子質(zhì)量約60.9 kD的PEPCK融合蛋白（圖3），其中PEPCK的預(yù)計分子量60.1 kD，pET-28a表達(dá)的融合標(biāo)簽為0.8 kD。對照組均未表達(dá)PEPCK蛋白。

2.4 PEPCK蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

2.4.1 溫度對重組蛋白表達(dá)的影響 當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃時，PEPCK的融合蛋白、可溶性蛋白及包涵體蛋白均有表達(dá)（圖4）；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃時，PEPCK融合蛋白、包涵體蛋白表達(dá)量較28℃時高，但在可溶性蛋白中幾乎為零。

2.4.2 IPTG濃度對重組蛋白的影響 結(jié)果顯示，PEPCK蛋白在濃度為0.2 mmol/L-1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)量無顯著差異，表明IPTG濃度變化對PEPCK表達(dá)量無明顯影響（圖5）。

圖3 PEPCK蛋白SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of PEPCK protein

圖4 溫度對PEPCK蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Influence of temperature on the expression of PEPCK protein

2.4.3 誘導(dǎo)時間對重組蛋白的影響 PEPCK蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間增長呈現(xiàn)出先增加后穩(wěn)定的趨勢，在8 h表達(dá)量達(dá)到最大（圖6）。綜上，PEPCK蛋白最佳表達(dá)條件為28℃、0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h。

2.5 His-PEPCK蛋白的純化

融合蛋白經(jīng)his親和層析柱純化后，經(jīng)SDSPAGE進(jìn)行檢驗。結(jié)果顯示，在洗脫液濃度為250 mmol/L時可獲得大量純化蛋白（圖7）。

2.6 PEPCK蛋白的乙酰化及琥珀酰化修飾的鑒定

分別使用抗乙酰賴氨酸抗體和抗琥珀酰賴氨酸抗體進(jìn)行Western-blot分析，鑒定PEPCK的乙酰化、琥珀酰化修飾。結(jié)果顯示，PEPCK蛋白具有乙酰化（圖8-A）和琥珀酰化修飾（圖8-B）。

圖5 IPTG濃度對PEPCK蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Influence of IPTG concentration on the expression of PEPCK protein

圖6 誘導(dǎo)時間對PEPCK蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Influence of induction time on the expression of PEPCK protein

3 討論

圖7 PEPCK蛋白的純化Fig.7 Purification of PEPCK protein

圖8 PEPCK蛋白的乙酰化（A）及琥珀酰化（B）鑒定Fig.8 Acetylation and succinylation identification of PEPCK protein

隨著基因表達(dá)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，人們不僅關(guān)注蛋白的表達(dá)量，更注重正確的翻譯后折疊、修飾，使表達(dá)蛋白的活性和穩(wěn)定性更高［31］。溫度是大腸桿菌生長代謝的重要影響因子，低溫條件下蛋白質(zhì)的合成速率降低，疏水作用降低，多肽折疊的動力學(xué)改變可以增加正確折疊的蛋白含量［32］，并及時將產(chǎn)生的前蛋白運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)腔或培養(yǎng)基，降低了形成包涵體、阻礙蛋白分泌的幾率［33］。在37℃時大腸桿菌生長最快，細(xì)胞膜流動性和蛋白合成速率增加，但胞內(nèi)前蛋白堆積過多會導(dǎo)致包涵體的形成增加［34］。本研究設(shè)置28和37℃兩個溫度，相比之下誘導(dǎo)溫度為28℃時PEPCK蛋白表達(dá)效果更佳。采用不同IPTG濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，在0.2 mmol/L-1.0 mmol/L范圍內(nèi)蛋白表達(dá)量無明顯變化，這與彭傳林等［35］發(fā)現(xiàn)IPTG濃度對家蠅抗真菌肽（MAF-1）目的蛋白的表達(dá)無顯著影響相符，因此實驗過程中使用0.2 mmol/L的IPTG即可。溶藻弧菌PEPCK蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間的增長，呈先增加后穩(wěn)定的趨勢，誘導(dǎo)8 h時達(dá)到峰值，而陳立明等［36］發(fā)現(xiàn)DTD蛋白誘導(dǎo)5 h表達(dá)量最高，可能是因為不同蛋白之間存在差異，導(dǎo)致所需的誘導(dǎo)時間不一致。

蛋白質(zhì)組學(xué)的突起，尤其是質(zhì)譜儀靈敏度、速遞和自動化的大幅提升，使蛋白質(zhì)翻譯后修飾大規(guī)模化研究成為可能［37］。賴氨酸乙酰化是一種普遍存在的蛋白調(diào)控方式，能對細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，特別是對代謝酶進(jìn)行精確調(diào)控［38-39］。細(xì)胞中這種精確調(diào)控的實現(xiàn)，得益于賴氨酸乙酰化酶和去乙酰化酶的相互作用［40］。在霍亂弧菌中，醋酸的代謝受去乙酰化酶的調(diào)節(jié)，該酶的缺失會導(dǎo)致其對黑腹果蠅的毒力降低［41］。此外，乙酰化修飾轉(zhuǎn)錄因子如CRP、PhoB可直接參與霍亂弧菌毒力的調(diào)節(jié)［42］。隨著各種翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究表明賴氨酸乙酰化修飾與琥珀酰化修飾具有高度重合的現(xiàn)象，共同影響代謝途徑中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能［43］。已知PEPCK與副溶血弧菌的耐藥性及毒力相關(guān)，且具有乙酰化和琥珀酰化修飾［30，44］。PEPCK作為溶藻弧菌糖代謝中的關(guān)鍵酶，在輔助因子乙酰輔酶A的作用下，乙酰轉(zhuǎn)移酶催化其賴氨酸殘基發(fā)生乙酰化修飾［45］。而發(fā)生在賴氨酸殘基上的琥珀酰化可促進(jìn)更多蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，在生理pH下電荷從+1到-1，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)整［46］。大腸桿菌也含有賴氨酸乙酰化轉(zhuǎn)移酶和琥珀酰基供體，利用大腸桿菌重組表達(dá)PEPCK蛋白時可在其賴氨酸殘基上進(jìn)行乙酰化和琥珀酰化修飾［47］。此外，通過比較大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn)的乙酰化位點及琥珀酰化位點，有66%是重疊的，表明兩種修飾可以發(fā)生在同一位點上［48］，因此實驗結(jié)果中PEPCK蛋白同時具有乙酰化修飾和琥珀酰化修飾是合理的。

總的來說，本研究使用鼠抗乙酰化賴氨酸抗體、鼠抗琥珀酰化賴氨酸抗體作為一抗，驗證了溶藻弧菌PEPCK既有乙酰化修飾，又有琥珀酰化修飾，為進(jìn)一步探究PEPCK的乙酰化和琥珀酰化修飾對溶藻弧菌的毒力及耐藥性的影響奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建溶藻弧菌PEPCK重組表達(dá)菌株，其最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.2 mmol/L IPTG，28℃誘導(dǎo)8 h；經(jīng)鑒定PEPCK蛋白具有乙酰化修飾和琥珀酰化修飾。