葡萄種子休眠研究進展

李上云 王晨 宣旭嫻 任艷華 房經貴

（南京農業大學園藝學院，南京 210095）

葡萄是世界上重要的栽培果樹之一［1-2］。葡萄栽培品種隨市場需求不斷變化，市場對葡萄品種多樣化的要求日漸增強，因而品種選育成為葡萄研究的一項極為重要的工作。雜交育種一直以來是葡萄育種的主要途徑，但雜交種子的萌發率低卻是影響雜交育種效率的關鍵因素。研究表明，休眠是種子萌發所需條件的一個關鍵因子［3-4］，但往往因休眠特性復雜、萌發率低，導致種子成苗效率低下，嚴重影響新品種選育效率。葡萄作為世界上最古老的果樹樹種之一，因其分布范圍廣，生長環境變化大，種子形成了明顯的休眠特性［5］，即在一定時間內，具有生活力的種子在適宜的環境條件下不能完成萌發。對于葡萄育種而言，一方面，若種子休眠期短、萌芽整齊一致、發芽迅速、成苗快和成苗效率高，則育種效率高；另一方面，若休眠時間較長且不同種群差異大和種子萌發率低，特別是雜交后代種子成苗質量差，則會成為制約葡萄育種效率提高的嚴重問題［6-7］。

近年來，對葡萄種子休眠及其調控的研究已取得了一定的進展［8-9］，多集中于葡萄種子類型、休眠形成機制、休眠調控和促進萌發等方面，但各研究之間的關聯度較差，知識點較為分散，休眠機制尚不明晰，未能形成合理的理論體系。目前，因為葡萄不同群體間休眠差異較大，后代種子所體現的休眠程度不一，調控機制無系統報道，加之種子萌發率低，導致成苗質量差，技術體系也難以形成，嚴重影響了葡萄育種效率。為促進種子休眠及萌發研究的發展，本文對上述研究內容進行梳理綜述，以期形成葡萄種子休眠的系統架構，為深入研究休眠機制和解決種子休眠與萌發的問題提供理論依據，同時也為種子休眠與萌發機制的研究指明方向。

1 休眠類型

種子休眠形成不僅受自身遺傳物質的控制，也受發育過程中環境的影響。休眠類型研究一般從“空間”和“時間”兩方面出發［6］。“空間”上將種子休眠分為種殼休眠（物理休眠、化學休眠和機械休眠）、胚休眠（形態休眠和生理休眠）和復合型休眠；“時間上”將種子休眠分為先天性休眠、二次休眠和無休眠；基于Nikolaeva［10］提出的生理學休眠類型，Baskin等［11］把種子休眠分為5類（即5類休眠法）：生理休眠、形態休眠、形態生理休眠、物理休眠和復合休眠，后者在生態學上使用較為廣泛。在Baskin［11］提出的休眠歸類理論的基礎上，Linkies等［12］研究認為，大多數核心真雙子葉植物基本屬于生理休眠。在葡萄胚休眠過程中，誘導種子胚休眠的不是胚自身，而是胚外圍組織或器官（果肉、種皮和胚乳等）；甘陽英等［9］對不同種源的葡萄種子休眠及萌發特性研究中得到葡萄種子休眠屬于生理休眠，確定種子休眠是由胚外圍組織導致，且不同種群休眠程度不一（休眠程度：東亞種＜歐亞種＜歐美雜交種＜美洲種），由此可明確葡萄種子休眠類型（圖1），為調控葡萄種子休眠解除和萌發提供理論依據。

圖1 種子（葡萄種子）休眠歸類Fig.1 Dormancy classification of seeds (grape seeds)

2 休眠機制假說

葡萄種子的休眠機制一直是葡萄研究的一個重要方向，因其形成較為復雜，盡管已在分子生物學方面有了較深入的研究，但到目前為止，也未能解釋其核心問題。有學者指出，種子能否萌發成苗，是胚的生長沖力與種殼或其他外圍組織的阻力此消彼長的結果［6，13］。因此，葡萄種子休眠機制的研究中，本質是探究如何提高胚生長沖力或降低外圍組織阻力，推斷二者何為種子成苗的主因。圍繞這一核心，國內外眾多學者主要將種子休眠機制的假說分為2大類，即形成激素理論和氧化理論（圖2）。

2.1 激素理論

圖2 種子休眠形成機制Fig.2 Formation mechanism of seed dormancy

1964年ABA從植物體中被分離出來，后有研究者發現其就是致使種子休眠的內含發芽抑制物［6］。Amen［14］考慮到赤霉素（gibberellin，GA）具有促進發芽的作用，于1968年提出激素平衡理論，認為GA誘導產生各種水解酶的作用會被具有抑制能力的激素消解，從而抑制種子發芽，使其表現出休眠狀態；當GA作用強于抑制物時，種子可正常發芽。

1975年，基于前述理論，Khan［15］認為種子內各種激素分工平衡，提出新平衡理論，但未能解釋為何外源添加GA與細胞分裂素（cytokinin，CTK），仍有大部分種子無法發芽的問題。隨著分子生物學的發展，植物突變體的出現，使激素理論取得較大進步。Karssen等［16］學者根據一系列研究，提出種子休眠的激素分工理論（遙控理論），其表明種子休眠與脫落酸 （abscisic acid，ABA）有關，GA與種子能否發芽相關聯；雖然該理論一定程度上豐富的激素平衡理論，但是仍未能解決休眠性如何維持的問題。基于此理論，研究人員利用突變體進一步開展了種子休眠基因的調控研究［17-18］。研究發現種子休眠的解除可能與ABA與GA的互作有關。Bill［19］研究發現，ABA可以調控GA的代謝及其信號傳導，反之亦可。Linkies等［12］認為種子的休眠可能與乙稀、茉莉酸鹽等激素有關。另外，近年來大多數研究表明：通過外界條件（光、溫度和水分等）調控GA、ABA相關基因，以此調節種子休眠。雖然，GA促進種子發芽的具體機制仍不清晰，但ABA等激素具有抑制葡萄種子發芽、促進休眠的作用已明確［20-24］。這一結論進一步輔證了激素理論，為激素調控葡萄種子休眠提供了理論依據。

2.2 氧化理論

Roberts［25］通過一系列稻粒發芽的研究指出，種殼是導致休眠的重要因素，通過排除法推理得出稻殼阻礙種子吸收氧氣，而氧氣對種子發芽的影響較大，同時提出若糖酵解作用（TCA循環）在氧氣充足的前提下，N3-、CN-等呼吸抑制劑處理種子，理論上可延遲種子發芽。盡管如此，但該推論仍無法解釋某些現象，因此通過大量研究之后，1969年Roberts［26］第一次提出戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）假說，認為種子發芽與否，取決于PP途徑運行狀況，并解釋了氧氣與促進休眠種子發芽的關系。該假說明確了種子發芽初期細胞的需求與PP途徑的相關性，且兩種途徑都存在于一般生物系統之中，C6/C1在0-1之間。PPP假說雖指出PP途徑是種子發芽的前提條件，但對于PP途徑為何無法在休眠種子中進行尚未有明確的解釋。

基于Roberts［27］提出得呼吸抑制劑或硝酸根調控種子休眠的論斷研究，另一些研究者［28-29］得出的發現休眠種子一般呼吸作用較強，吸收氧的能力強于PP途徑。郭華仁等［6］研究發現，呼吸抑制劑可促進發芽是由于此類藥劑破壞了種殼的氧化酶活性，使氧氣易于被種子吸收。近年來，一些新的相關研究指出，活性氧化物（H2O2、HCLO和HO等）作為氧代謝產物，在信息傳遞及體內平衡上至關重要，且可能通過激素對后熟種子休眠或發芽進行調控。Nambara［30］研究也發現，種子中氧含量的多少，影響種子發芽抑制物（ABA）含量，從而影響種子休眠與發芽。

種子休眠性很大程度表現在胚、胚乳及種殼上，其形成受遺傳所控制。近年來，從分子生物學角度研究休眠，成效較佳［28，30-33］，一般分為成熟調節、激素調節、休眠解除和表現遺傳等（圖3）。在水稻等作物上發現PYR/PYL/RCAR基因與ABA受體相關，ABA敏感度與ABI1與ABI2關聯［34］。另有研究表明，脫氧酶NCED基因是大多數植物的ABA合成所需的，若發生突變，ABA則無法合成，后熟種子休眠性降低。

眾多研究表明，葡萄種子作為后熟種子，其休眠機制基本符合激素理論和氧化理論，二者雖尚未完全解釋葡萄種子休眠機制，但二者之間相互聯系，為闡明種子代謝作用以及種子休眠機制提供了重要理論依據，同時也為解除葡萄種子休眠提供了重要參考。

圖3 種子休眠部分相關基因（擬南芥、水稻）Fig.3 Some genes related to seed dormancy (Arabidopsis thaliana and rice)

3 休眠與萌發的調控

種子休眠是植物長期演化獲得的環境適應性，休眠特性與其地理起源和分布地的環境條件有關［36-37］。葡萄種子的休眠與萌發調控主要依據激素理論和氧化理論，圍繞如何降低種子內生長抑制劑含量與增加種子內生長物質含量和減少種殼（外圍組織）阻力與提高胚內氧氣含量等問題進行探究。為找到快速解除葡萄種子休眠和提高種子萌發的方法，前人開展了大量研究，盡管取得了一定進展，但尚未開展系統綜述，且未找到高效調控的技術。為此，基于前人研究，并對其進行系統地歸納總結，繪制出種子休眠機制形成基本調控圖（圖4），以期為研究葡萄種子高效破眠與萌發技術提供經驗和理論參考。

3.1 物理調控

3.1.1 溫度與層積處理 通過調控溫度，將種子層積處理，是打破種子休眠的主要方法。按溫度范圍及變化，可以分為低溫層積（冷層積）、常溫層積（暖層積）、變溫層積。甘陽英等［9］為探究葡萄種子休眠與解除的規律，利用3個不同分布中心的種群及其雜交種的20個品種，研究冷層積、常溫層積、變溫層積等方法打破葡萄種子休眠的效果，發現暖層積打破葡萄休眠種子效果不佳，冷層積（4-5℃）和變溫層積［即20℃（14 h）/10℃（10 h）和30℃（14 h）/20℃（10 h）］2個月可以有效打破歐亞種、東亞種及其雜交種（歐山雜種）的休眠；但對于打破美洲種及歐美種的休眠，變溫層積和暖層積皆無效果，冷層積時間延長至5個月及以上可打破休眠，因此，打破葡萄種子休眠的研究主要集中在用冷層積方面。

通過模擬自然條件打破種子休眠的研究發現，低溫層積法可以軟化種皮、增強透性、降低脂類物質等抑制劑的含量、增加赤霉素的含量等，從而可以達到誘導休眠種子萌發的目的［31］。崛內昭作作等［37］研究發現，胚的休眠與果實成熟期相關，對于完熟的葡萄種子，5℃層積3個月可以打破休眠；于桉［38］利用不同方法處理山葡萄種子，冷層積處理4個月，發芽率可達61.4%，高于其他處理；甘陽英等［5］研究總結出葡萄屬不同種群種子休眠程度深淺的規律，即：歐山雜種＜歐亞種＜歐美雜種＜美洲種，且雜種的休眠程度淺于其親本；林玲、李偉東和Heo等［39-41］發現，冷層積對打破不同倍性葡萄種子的休眠效果存在差異，四倍體葡萄萌發率低于二倍體葡萄；羅堯幸等［42］得出冷層積4個月后，不同品種葡萄種子萌發率不同，“北冰紅”萌發率（89.5%）最高，“赤霞珠”（50.0%）最低。

圖4 葡萄種子休眠與萌發基本調控Fig.4 Basic regulation of grape seed dormancy and germination

上述研究表明，低溫層積處理可在一定程度上打破葡萄種子休眠，但對打破不同倍性及不同種群的葡萄種子的休眠程度存在差異。因此，研究層積處理與打破不同種群葡萄種子的休眠之間的關系，對葡萄雜交種子休眠解除與萌發具有重要意義。

3.1.2 機械處理 葡萄種子休眠是由于胚休眠導致，種殼及其外圍組織致使其透性不良是引起休眠的其中一個原因，因此可通過機械的方法打破外圍組織的束縛，增加氧氣及提高透性，以促進發芽和解除休眠。甘陽英等［9］，以不去種皮為對照，用除去種胚端的種皮（不損傷胚乳）；除去種胚端的種皮和胚乳；剝取完整胚等處理，探究葡萄種皮和胚乳對萌發的作用發現，歐美雜種“京亞”除外，去除種胚端的種皮、種皮和胚乳后（胚珠完整），離體種胚的萌發率顯著增加。這些研究表明機械處理有助于促進葡萄種子萌發，這為提高葡萄雜交種子萌發率提供了理論依據。

3.2 化學調控

3.2.1 激素處理 大多研究表明，乙烯、細胞分裂素（CK）、赤霉素（GA3）、萘乙酸和乙烯利等植物生長調節劑能打破某些種子的生理休眠。如卓小能等［21］研究發現，利等植物生長調節劑能打ABA含量較高，用40%石灰氮浸提液浸泡18 h，可打破其休眠；劉會寧等［21］證明了生長調節劑在一定程度上能夠促進種子發芽，但不同藥劑處理對同一品種發芽效果存在差異，同一藥劑處理對不同品種發芽效果也存在差異。潘學軍等［43］在外源激素處理對貴州毛葡萄種子發芽的影響研究中指出，GA、6-BA對毛葡萄種子活力都有顯著的提高，但 GA處理的發芽整齊、幼苗質量高、整體效果好。而Huseyin等［44］在研究打破葡萄種子休眠過程中發現，1 500 ppm的GA3處理后，種子萌發率可達51.72%。而潘學軍等研究發現，一定濃度的GA3可顯著提高種子萌發效率，且不同品種所需濃度不同定濃度。張艷和王慶蓮等［45-46］對GA3打破歐亞種葡萄種子休眠的研究中發現，葡萄種子在2 000-2 500 mg/L的GA3溶液中浸泡24 h，萌發率約60%。因此，盡管激素處理葡萄種子能在一定程度上打破休眠和提高散發率，但不同激素在不同種群葡萄種子休眠打破方面的作用不盡相同。

3.2.2 無機化學藥劑處理 研究發現，濃硫酸、高錳酸鉀、次氯酸鈉和過氧化物等無機化學藥劑對打破由外圍組織束縛而引起的種子休眠有一定的作用。甘陽英等［9］通過濃硫酸處理葡萄種子休眠發現：濃硫酸可打破部分種子休眠，且能提高萌發率，但不同品種所需的濃度及時間不同，濃度和處理時間不當會毒害種子，在一定程度上體現出，無機化學藥劑對打破葡萄種子休眠的具有局限性。

3.3 基因調控

目前，學者們已鑒定了大量編碼休眠調控蛋白的基因［47］（圖3），主要分為調節休眠誘導和維持以及與休眠釋放有關的蛋白，其中DELLA等蛋白與休眠釋放和調節GA生物合成有關，且可以調控種子萌發及休眠［29，31］。據研究報道［48-50］，GA 受體GID1、DELLA蛋白、F-box蛋白和DELLA調控的靶因子構成核心GA信號轉導途徑，GA與GID1的結合促進GID1與DELLA抑制因子相互作用，從而通過泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin proteasome pathway）引起DELLA的降解和GA響應［51-52］，抑制種子休眠形成；DELLA基因突變（RGA-LIKE2、SPINDLY，即RGL2、SPY），可影響GA生物合成基因，如擬南芥種子的AtSdr4L突變體atsdr4l，引發GA生物合成降低［53-55］，抑制萌發；GA處理或加強GA信號，一方面可上調GA3ox1和GA20ox1的表達及下調GA2ox1的表達［56-59］，增強GA的合成與信號（ABA的分解代謝），促使種子由休眠狀態向萌發轉變；反之， 使 GA3ox1、GA20ox1、GA20ox2和 GA20ox3的轉錄水平下調；另一方面上調GA2ox1和GA2ox2（GA分解代謝基因）的轉錄水平，一定水平上促ABA信號（ABRES）傳遞，促進種子休眠。

ABI3、ABI4是ABA信號傳導的主要組分［46］，ABI3是下游組分，其表達受DEP（DESPIERTO）調節，參與種子發育調控，dep種子表現為完全休眠；種子成熟與萌發過程中，ABI3轉錄可被WRKY41直接控制，以此調節擬南芥種子的休眠；MYB96通過介導ABI4（種子休眠的正調節因子）和ABA 生物合成基因（NCED2 和NCED6）的表達，調節種子休眠與萌發；ABI4 可正調節ABA 的分解代謝基因和負調節GA的生物合成基因，促進種子休眠并抑制萌發；ABI5負調節種子萌發；CHO1即CHOTTO1（AP2結構域的轉錄因子）和SPT是種子休眠中的重要因子，與ABI4關聯度大，SPT-ABI4模塊對種子休眠的建立和維持起著關鍵性作用，AP2 的轉錄因子在ABI4的上游起作用，負向調節GA 生物合成，同時正調節ABA 生物合成，促使種子休眠。除此之外，ABA可影響組蛋白乙酰轉移酶HvGNAT/MYST、蛋白甲基轉移酶基因KYP/SUVH4等，參與休眠釋放。雖然進展相對較慢，但激素合成相關基因的挖掘，一定程度上揭示了激素調控休眠的機理（圖5），從分子生物學角度為激素調控葡萄種子休眠與萌發提供了理論依據。

3.4 混合調控

植物種子的生理休眠基本上都是由胚和種殼雙重原因引起的，往往采用混合手段對其破眠。在葡萄種子的破眠上，Huseyin等［44］利用GA3+層積的組合研究發現，葡萄種子先用1 500 ppm的GA3處理，再層積35 d，種子萌發率可達53.21%。Uzun等［60］分別用1 000 ppm的GA3、1 000 ppm的BAP、1 mol/L的H2O2和水浸泡24 h后，5℃層積4個月，結果表明GA3處理結合層積處理，葡萄種子萌發率提高到78.32%。除葡萄種子破眠上應用混合手段外，其他種子也有應用，如對石刁柏種子萌發研究中，牛曉雪等［61］采用不同激素和化學試劑處理混合處理種子，結果表明10 mg/L IAA＋0.5% FeSO4組合能顯著提高種子萌發率至95%，提高發芽高峰至34%，有效縮短發芽時間，提高成苗效率，一定程度上為混合手段促進葡萄種子高效成苗提供了可行性依據。

圖5 基因調控種子休眠與萌發的網絡Fig.5 Gene-regulated network for seed dormancy and germination

4 總結與展望

盡管葡萄種子休眠相關的研究取得了一定進展，但仍存在較多問題，需要結合現代先進技術進一步探究其休眠與調控機制。具體研究方向如下：（1）葡萄種子休眠與萌發是兩個不同的過程，即獨立又相互聯系，種子完熟后，只有先打破休眠才能萌發，但休眠和萌發又沒有明確的界限及標志；（2）與葡萄芽子休眠相比，葡萄種子休眠機制尚未明晰，且鮮有關于葡萄種子休眠在基因組學方面的研究，葡萄休眠相關的基因和蛋白質組急需挖掘；（3）激素調控方面，雖掌握了ABA與GA和乙烯的關系（ABA誘導休眠，GA和乙烯釋放休眠并拮抗ABA 的作用），但尚未明確激素調控技術的核心；（4）休眠與萌發調控方面，目前仍以冷層積、赤霉素等單一技術為主，綜合技術研究較少。

上述問題的研究與解決對于打破葡萄種子休眠、促進種子萌發高效技術的研究具有重要意義，同時也為解決葡萄雜交種子萌發率低的問題指明研究方向，一定程度上促進葡萄育種的進程，也為其提供理論依據與實踐參考。