植物VIGS技術及其在林業科學中的研究進展

高鵬飛 席飛虎， 張澤宇 胡凱強 陳凱 魏文桃 丁家治 顧連峰

（1.福建農林大學林學院 基礎林學與蛋白質組學中心，福州 350002；2.福建農林大學生命科學學院，福州 350002）

最新一代的Nanopore納米孔測序技術和PacBio的異構體測序（Iso-Seq）技術可便捷鑒定出長片段的基因信息［1］，現在已經廣泛運用在植物學研究之中［2］。由于測序技術的飛速發展，測序儀器更加便攜，檢測時長大大縮短，所以不同植物物種的基因組序列信息也隨之激增［3］，包括銀白楊（Populus alba）［4］、挪威云杉（Picea abies）［5］、木麻黃（Casuarina equisetifolia）［6］等林木基因組被測序。雖然大規模高通量的基因序列已知，但相對應的基因功能分析卻相對滯后，特別是確定林木物種基因功能仍然是一項艱巨的任務，因此開發對應物種實用高通量的基因功能研究工具極為重要。

目前林木存在樹體高大、世代周期長、外源基因表達困難等問題［7］。利用植物穩定過表達可以定向改造植物的遺傳特性在林木研究中雖已有應用報道［8］，然而會受植物組織再生率、調控元件、轉化頻率等條件的限制，并且多數林木物種的穩定遺傳轉化體系較為困難，特別是在裸子植物針葉樹種中。化學誘變、輻射誘變、T-DNA插入、基因槍微彈轟擊等手段［9］都也可以引發植物基因功能的喪失或者整合外源基因，但這些技術難以做到高效特異性的靶向目的基因。針對以上兩種問題使用VIGS可作為研究林木基因功能的一種快速有效的替代方案［10］，該技術與 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）都屬于轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）［11］。VIGS 利用了病毒侵染植物后引發RNA沉默，病毒被設計修飾后成為攜帶植物自身基因轉錄物的片段則會靶向降解該特定內源基因的轉錄本序列從而引發靶基因序列的特異性沉默達到研究該基因功能的目的［12-13］。簡而言之，這是一種植物運用自身特異性降解病毒基因組的先天防御途徑［14］所形成的反向遺傳學工具。早在1995年 Kumagai等［15］就將本氏煙（Nicotiana benthamiana）中八氫番茄紅素脫氫酶基因（phytoene desaturase，PDS）的cDNA片段置于煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）中，對本氏煙進行侵染后葉片出現出了白化的表型并成功抑制了內源PDS基因的表達。這種技術有望成為在林木物種中探究基因功能的利器。本文將系統綜述VIGS技術的機制和相關技術細節，同時著重討論VIGS在林木基因功能研究中的應用。

1 VIGS機制

植物具有多層防御策略來防御病原體的傳播，可以在植物體單細胞和整個生物體水平上對抗病毒感染。病毒在傳播復制期間會形成的雙鏈RNA（double-stranded，dsRNA）從而觸發宿主的第一級防御反應［16］。植物細胞內的抗性蛋白核苷酸結合亮氨酸重復受體（nucleotide-binding leucine-rich repeat，NB-LRR）可以檢測細胞內活性［17］觸發第二級免疫策 略 ETI（effects Sub-triggered immunity）的啟動，從而控制感染部位細胞的程序性死亡從而限制病原體在植株體內的傳播。來自于病毒的感染性克隆被稱為病毒載體，靶基因與病毒載體相連接后將重組病毒載體侵染入植物細胞開始轉錄翻譯，植物開啟自身第一級防御系統開始VIGS進程（圖1）。來自于病毒的RNA通過RNA依賴性RNA合成酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDRP）形成了包含發夾結構的dsRNA［18］。dsRNA被宿主編碼的核酸內切酶（dicer-like，DCL）蛋白識別，其中DCL4和DCL2蛋白直接參與RNA病毒防御系統［19］，DCL4是植物細胞中對病毒的主要防御者，抑制病毒在細胞間傳播對VIGS進程起到了負調控作用，也是細胞內VIGS開始觸發的主要因素。DCL2可以促進細胞間進行基因沉默的信號因子擴散，還能夠靶向降解植物細胞中的病毒RNA是VIGS體系中必不可少的一部分。DCL蛋白將dsRNA切割成21-24個核苷酸的小干擾 RNA（small interfering RNAs，siRNA）。由DCL蛋白產生的雙鏈siRNA被分離為單鏈siRNA加載到AGO（argonaute）蛋白上，將這些siRNA進一步加載到RNA誘導的沉默復合體（RNA induced silencing complex，RISC）上組成了效應子復合物［20］，引導siRNA與植物內源的的RNA靶向互補結合后通過核酸內切酶對轉錄物的裂解來沉默RNA造成基因功能的喪失［21］。

2 VIGS研究方法

2.1 VIGS載體構建流程

VIGS涉及3個主要過程：設計靶向沉默宿主基因片段與病毒基因載體進行連接；以適當的方法感染植物宿主；植物進行防御病毒機制沉默靶基因［22］。為了對較大的文庫進行篩選，Liu等［23］建立了含有Gateway克隆位點的煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）載體，去除了冗長的亞克隆步驟。VIGS載體構建克隆的植物靶基因的片段通常為300-500 個堿基對（base pairs，bp）［24］，該長度片段能夠有效的產生siRNA，短片段會降低沉默效率，而過長的片段會增加沉默脫靶的可能性。插入序列的大小上限取決于病毒在細胞中的移動快慢、病毒載體的大小、以及病毒在不同植物物種中的感染效率。在對煙草的研究結果顯示，即使是來自相同靶基因的不同區域的相似大小片段都可導致不同的沉默效率，本氏煙中200-1 300 bp的插入片段范圍內都可以導致有效的基因沉默［25］。因此針對不同基因的VIGS實驗都需考慮沉默目標的靶基因區域。另外 應 通 過 BLAST（basic local alignment search tool）進行比對來確定構建的基因片段是否具有特異性。靶基因目標片段一般選擇在3′UTR區域的序列［25］，因為基因中這部分序列具有高度保守性，特異性的基因片段能夠導致特異性的沉默。構建載體時可以在病毒載體中插入多個基因片段以擴大靶向范圍沉默不同的基因，Peele研究出使用番茄金色花葉病毒（tomato golden mosaic virus，TGMV）構建的VIGS載體在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中共同沉默了鎂螯合酶亞基基因（magnesium chelatase subunit，SU）和增殖細胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）［26］。Turnage 等［27］構建的白菜卷葉病毒（cabbage leaf curl virus，CbLCV）VIGS載體也可在擬南芥中同時沉默CH42和PDS兩個基因。

圖1 VIGS分子機理Fig.1 Molecular mechanism of VIGS

2.2 VIGS接種侵染技術

TRV介導的VIGS是在雙子葉植物中使用最廣泛的VIGS體系之一，在較多的植物物種中都已經成功侵染，并表現出較高的沉默效率。TRV載體研究本氏煙和番茄（Solanum lycopersicum）的VIGS技術相對較成熟［28］，將構建好的病毒載體導入幼苗中，隨著植株的生長，病毒從接種部位擴散到植物的發育區域并開始進行PTGS過程。基因沉默后表型產生與病毒傳播的速度一致，輕微的病毒癥狀通常在接種7-10 d后開始產生，在2-3周內向植株新生的幼嫩葉片擴散，通常在3周之后即可產生最易觀察的表型。針對不同植物種類和實驗類型的研究目的，已經開發了多種農桿菌對植物接種侵染的不同方法。例如通過用牙簽挑選農桿菌并將牙簽刺入幼苗葉片中就可以充分感染，對葉片、葉腋分生組織進行注射滲透，真空滲透，或者用農桿菌噴灑幼苗也都可以獲得良好的沉默效果［23，29］。使用農桿菌進行侵染的方法還應針對不同物種進行開發改進，以及對病毒載體進行改造，優化接種技術。TRV這樣的二元病毒，其中PTRV1含有編碼RNA依賴性RNA聚合酶，運動蛋白和16K富含半胱氨酸蛋白的基因，PTRV2含有編碼外殼蛋白的基因和用于克隆目的基因的限制位點。基于TRV的VIGS載體需要PTRV1和PTRV2兩組分的混合共表達才可以發揮侵染作用。如以最廣泛使用的TRV載體為例展示了侵染技術路線（圖2）。

2.3 接種后植株的環境影響

植物生長的外界壞境對病毒載體侵染植株的活性有直接影響［30］，在環境因素中溫度是影響病毒有效傳播的最重要因素之一。糧食作物多為單子葉植物，具有較高的經濟價值。針對小麥（Triticum aestivum）感染病毒的最適溫度研究發現，其生長的最佳環境溫度為15-20℃。中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）在低溫17℃下對小麥PDS基因的沉默效率達到了70%-84%從而產生了明顯的光漂白現象，而同樣溫度下大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）和狐尾花葉病毒（Foxtail mosaic virus，FoMV）并未造成任何的沉默表型［31］。高粱（Sorghum bicolor）感染雀麥草花葉病毒（Brome mosaic virus，BMV）后在溫度22℃下僅有10%的植株產生病毒感染癥狀［32-33］，對實驗體系進行了環境溫度的改進發現高粱接種BMV沉默載體后轉移至環境溫度為18℃溫室中生長4周，植株出現基因沉默的表型為100%，顯著提高了VIGS實驗的沉默效率［24］。因此在實驗中檢測病毒適宜感染的溫度和觀測病毒感染起作用的時間都應該進行預先的實驗探究［34］。

圖2 VIGS侵染技術示意圖Fig.2 Schematic diagram of VIGS infection technology

針對雙子葉模式植物本氏煙和番茄進行基因沉默實驗通常使用TRV體系，植株在20-22℃的溫室中生長3周就可以產生明顯的白化表型［35］，然而在對番茄基因沉默體系進行改進時發現在低溫15℃環境時番茄葉片、花朵、果實中的PDS基因的轉錄本水平發生了更顯著的降低，葉綠素含量降低了90%以上［36］。雙子葉植物通常使用根癌農桿菌轉化法，轉化效率高低取決于環境溫度條件與農桿菌病原體之間的相互作用能否促成細胞外菌毛（etracellular pilus，T-pilus）的形成。Vir（virulence）基因的大量表達可促進T-pilus形成，它由VirA和VirG兩部分控制，高于28℃的溫度會抑制T-pilus的形成，并降低Vir蛋白的穩定性溫度，超過32℃會導致VirA磷酸活化功能的喪失從而降低Vir基因的表達［37］，因此不耐高溫的農桿菌株系無法在高于28℃情況下進行轉化［34］。實驗探索過程中必須在確定接種病毒的最佳方式以及維持植物良好的生長條件方面投入巨大的時間和人力成本。對于特定植物和病毒載體均有最佳溫度范圍來使病毒侵染并在植物體內傳播，因此在環境溫度可控的人工氣候室中進行VIGS實驗有助于獲得良好且可重復的的穩定侵染效率。

2.4 VIGS的實驗對照和沉默效果的評估

每個VIGS實驗中都要進行沉默有效性的檢測。常見的陽性對照是針對PDS基因和ChlH（chelatase subunit）基因進行的沉默［38-39］，會產生明顯的葉片變白表型。使用馬鈴薯X病毒（potato virus x，PVX）載體針對在光合作用第二階段中參與葉綠體類囊體發育的Ftsh（filamentation temperaturesensitive H）基因沉默后同樣也使本氏煙產生了白化表型［40］。在本氏煙和茄子（Solanum melongena）中也有針對SU基因沉默作為陽性對照［41-42］，植株葉片變黃產生了黃色斑點。這些基因都參與植物的光合作用，特異性沉默后可以使植株沉默區域產生最容易看見的光漂白表型。但是根據不同物種的特性也需要進行適時的改進，如果病毒感染所產生的表型與沉默PDS或ChlH所產生的白化表型比較相似的話，針對白化基因的沉默就不是衡量VIGS實驗是否成功的視覺標簽，所以為了解釋可能由于病毒本身引起的表型變化，在植物中接種不含目的基因的空載作為陰性對照是極為必要的。在對高粱基因沉默時針對植物發育的關鍵蛋白泛素基因（Ubiquitin，Ubiq）構建了載體作為陽性對照，沉默后使植株葉片產生了褐變的可變表型，因此沉默Ubiq就是高粱的最佳視覺標記基因［24］。

VIGS技術沉默基因的效率和特異性需要通過逆轉錄然后進行聚合酶鏈式反應（RT-PCR）來進行確認各種組織中基因的表達量和不同樣品實驗處理間基因表達的差異。實時定量RT-PCR在實驗進程中應該注意以下因素：提取高質量的RNA，有效去除DNA的污染，設計的引物無引物二聚體［43］。RTPCR引物設計的區域應該確保位于靶基因轉錄本的區域，但是要處于VIGS載體中克隆的序列之外區段，并且要確保特異性而非來自其他相似同源的基因［22］。

3 VIGS相關的軟件工具

植物在PTGS期間存在有基因沉默脫靶的高風險，VIGS實驗的成功需要確保靶基因的高度特異性，以及較高的沉默效率。現在已開發出許多軟件來輔助進行預測VIGS沉默效率以及構建VIGS載體（表1）。

4 VIGS在林木基因功能研究中的應用

在生命周期較長的多年生木本植物中，較長的世代限制了遺傳轉化體系的建立，所以建立快速可靠的轉化系統對于木本植物尤為重要。隨著林木中第一個多年生木本植物毛果楊（Populus trichocarpa）的全基因組序列的完成［54］，針對林木特有的性狀例如木材形成，多年生生長特性，季節性變化等這些在擬南芥和水稻這兩個模式植物無法解決的問題上開啟了新的研究領域［55］。由于病毒誘導的基因沉默具有實驗步驟易于操作且產生表型所需的時間比較短等優勢，VIGS已經從以下不同的方面運用在林木功能基因組學研究之中。VIGS系統在木本模式植物楊屬胡楊中及果樹、觀賞樹種中進行的基因沉默研究結果總結參見表2。

4.1 林木物種中病毒載體的開發建立

TRV載體在對林木物種中基因功能的探究中發揮了重要作用。與其他病毒相比TRV具有在植株中的傳播感染強，產生的病毒癥狀輕，可以更強烈降低基因的表達量等優點［69］，因此TRV在林木物種中得到了廣泛的運用。麻風樹作為礦物資源和生物染料的替代來源，其種子中含油量高達30%，利用TRV載體對麻風樹基因的高通量篩選后確定了其中脂肪酸合成、發育調控和自然毒素分泌3個功能相關的基因［57］。TRV載體還在經濟價值較高的果樹中成功運用，例如對桃子沉默ChlH基因，載體侵染桃樹幼苗葉子15 d后接種的區域就開始褪色最后產生了白化葉片［61］，以及在對櫻桃樹調節花色苷合成途徑的MYBA基因沉默后生長出缺少紅色素的櫻桃果實［62］。除此之外，TRV載體在抗逆性較強的林木物種中也被成功運用，例如運用VIGS技術在胡楊中沉默了PDS基因，在實驗中設置了溫度梯度對胡楊樹的侵染最適環境進行探究發現在28℃時沉默效率最高［56］，使其葉片產生了光漂白的表型。因此使用TRV載體在較難穩定轉化的林木中的應用具有較大前景。

表1 基因沉默相關設計軟件Table 1 Gene silence related design software

針對不同的林木物種應該開發建立特有的新病毒載體，以擴大VIGS研究體系范圍，進行最有效的基因功能研究。目前開發林木物種中的VIGS載體工具已經展開并獲得了初步的成功。感染相對廣泛的蘋果潛伏球形病毒（apple latent spherical virus，ALSV）最初就是從蘋果樹中分離出來，它是一種直徑為25 nm的球形小病毒［70］，由兩組分單鏈RNA基因組（RNA1和RNA2）和3種不同的衣殼蛋白組成［71］。盡管蘋果樹是ALSV唯一的自然宿主，但是它可以通過人工接種去感染擬南芥、本氏煙、重要的經濟農作物（番茄、黃瓜（Cucumis sativus）、大豆（Glycine max）、蘋果、葡萄（Vitis vinifera）、柑橘（Citrus reticulata））等［72-74］，在這些物種中ALSV都可以導致有效的基因沉默。木薯是全球最重要的塊根作物之一，全球八億多人以它生長產生的塊狀淀粉根為主食，盡管現在已有遺傳轉化方案，但是耗時較長且方法困難，并且受到生命周期長，雜合度高和近親衰退的限制［75］。基于木薯自身的非洲木薯花葉病毒（African cassava mosaic virus，ACMV）的VIGS載體可以快速高效地侵染木薯，針對PDS和標記基因UidA（β-glucuronidase enzyme）沉默后在木薯葉子、纖維根、塊狀根等這些不同器官中可視化的觀察到基因沉默結果［29］，證明了VIGS可以高通量的分析木薯基因功能。

表2 VIGS系統在楊樹屬等林木物種中的研究應用Table 2 Research and application of VIGS system in poplar and other forest tree species

4.2 林木物種中生長結構和激素相關基因解析

VIGS在林木中生長結構以及抗逆機制中的研究中具有重要意義。木質部次生細胞壁的形成為生產生物乙醇提供了必要的原料，工業生產中廣泛運用的木材和纖維也主要由次生細胞壁組成。與擬南芥相比木本植物的次生細胞壁調控網絡更加復雜，因此了解木本植物中次生細胞壁形成的特異性轉錄調控非常重要［76］。VIGS體系針對DUF579（domain unknown function 579）和 KNAT7（knotted-like homeobox of Arabidopsis thaliana 7）的基因沉默后，發現植株的細胞壁松弛，糖脂提取后顯示多糖提取率增加［77］，研究結果有助于深入了解木質部纖維素的產生機制。VIGS在研究樹木韌皮部中運輸mRNA等大分子快速響應干旱脅迫機制也發揮了重要作用。梨樹嫁接到砧木上后，RNA測序分析顯示PbDRM（pyrus betulaefolia drought responsive mobile gene）轉錄本豐度顯著增加，RT-PCR檢測到PbDRM從砧木轉移到接穗上從而使接穗的抗旱性顯著增加。并且通過VIGS下調PbDRM發現增加了梨樹的干旱敏感性，證明了PbDRM作為干旱脅迫下梨樹韌皮部的移動信號［60］。

木本植物的生長與生長素、赤霉素（GA）、細胞分裂素等激素有著顯著的相關性。GA的合成過程中植物特有的發育和信號傳導關鍵因子GRAS（GAI-RGA-and-SCR）蛋白質家族發揮了關鍵作用，并且GRAS在植物結構中具有重要的調節效應可促進枝條的下垂［78］，針對不同生長結構表型植物利用VIGS工具對GRAS基因功能的探究有助于深入了解結構控制機制。紫薇有枝干直立和枝條矮化下垂的兩個品種，使用TRV載體針對枝條下垂品種紫薇的GRAS1基因進行基因沉默，侵染15 d后發現下垂枝條出現了向上生長的表型，其中一些樹枝的分枝角度甚至接近于直立品種分枝的角度，30 d后產生了更多的腋芽和更多畸形的分枝［68］。該研究解析了林木中枝干下垂的調控機制，為林木的根枝生長和分層定位提供了重要基礎，在林木結構水平上闡明了分子功能［79］。

5 VIGS在林木基因功能研究中的局限性以及解決方法

VIGS可導致對非靶基因的表達抑制，產生脫靶沉默現象，造成基因的沉默效率降低，這在缺乏基因組測序數據的林木物種中更容易發生。脫靶沉默取決于多方面的因素［80］，如靶基因的位置，dsRNA的長度，轉化侵染植物的方法是否合適，VIGS載體感染的效率等方面［25］。針對上述問題在構建VIGS載體時可以使用SGN，siRNA-Scan等軟件來選擇基因沉默區域并且評估PTGS過程中所產生的21nt siRNA 是否能夠發揮的功效［44，46］。Zhou 等［81］提出一種構建載體的改進方法，使用70 bp的基因片段其中包含來自3個不同基因相互不匹配的21 bp堿基的片段，使用這種改進的方法可以減少VIGS的脫靶沉默現象并且特異性的敲除基因家族中的高度相似的成員。改進載體的同時也應該探索新的病毒誘導機制，Ossowski等［52］證明了卷心菜卷葉病毒（cabbage leaf curling virus，CaLCuV）和TRV在本氏煙中使用新開發的微小RNA介導的病毒誘導基因沉 默（microRNA-based virus induced gene silencing，MR-VIGS）方法，也可以降低脫靶現象的產生［82］。

VIGS難以完全抑制靶基因表達，因此即使降低了靶基因的轉錄水平但仍然可以產生足夠的功能性蛋白，所以在沉默的植物中可能未觀察到表型，或者表型不明顯。并且如果僅病毒接種植物就可以改變植物表型［83］，那么由于基因沉默而導致的細微表型有可能被病毒癥狀掩蓋，因此對沉默表型的解釋會變的更加復雜化。許多病毒在增殖和傳播過程中會刪除插入的基因［84-85］，因此在實驗過程中應當加入空載處理，有助于區分沉默基因所產生的表型和病毒載體誘導的癥狀［10］。

6 利用VIGS研究基因功能的優勢以及未來前景

研究基因功能的最簡單最有效的方法是減弱基因的表達或產生不編碼功能性蛋白質的突變體。隨著植物全基因組序列的獲得，需要大規模分析來確定數千個基因的功能。VIGS是新興的植物功能基因組學工具之一，雖然有一定的不足但也避免了許多傳統功能分析方法的局限性［86］，在基因鑒定和功能分析方面具有巨大的潛力。VIGS具有的優點以及在未來的前景方向主要包括以下幾個方面：

第一，VIGS不需要完善的參考基因組序列，只需要部分轉錄組序列的信息就可以對待研究的的目的基因造成基因沉默［87］。雖然現在高通量測序非常普及，但是很多林木類非模式物種依然沒有參考基因組序列，對于這種非模式物種的基因功能研究，VIGS明顯具有十分明顯的優勢。

第二，VIGS不需要穩定的植物遺傳轉化，實驗操作步驟簡單。可以在植物生命周期內的侵染短暫幾周后快速產生表型，因此在難以轉化的林木物種中基因功能的表征變得容易［22］。最近的研究表明，在植物在適當的條件下，VIGS在整個生命周期中可以進行持續長時間高效的VIGS［88］，甚至可以持續數年直到植物死亡。大豆中ALSV介導的VIGS針對PDS基因進行沉默后葉片出現了高度均勻的光漂白表型，并且在整個生命周期中穩定的維持了VIGS。基因沉默傳播到20%-30%的種子中，所有基因沉默的種子生長后的幼苗都表現出均勻的病毒感染癥狀和高沉默效率產生了白化表型［89］。到目前為止，VIGS 在植物激素代謝合成［90］、出苗活力［91］、花果實發育［92］、外界應激非生物和生物脅迫［93］及衰老凋亡［94］等生命過程中的基因功能驗證方面具有巨大潛力。特別是在那些難以進行轉化且沒有廣泛收集突變體的林木物種中，VIGS是一種較為有效的研究基因功能的技術。

第三，針對具有高度同源性的基因家族進行有效的特異性敲除。基因家族中的基因具有相似保守的基因結構和功能結構域，通過將具有相同保守序列的兩個或多個基因家族成員沉默，可以破解大多數基因家族參與的調節植物激素信號傳導和逆境調控相關機制，以及植物中碳水化合物的合成、衰老、發育和次級代謝產物的合成途徑［95］。真菌病原體（Setosphaeria turcica，ST）可以在玉米高粱葉片上引發葉枯病，是世界范圍內的流行性病害，ST抗性基因家族中都具有CC-NB-LRR（coiled-coil nucleotidebinding site leucine-rich repeats）蛋白結構域參與識別病原體啟動植物的防御反應。Martin針對ST基因家族中6個基因的共同區域設計了VIGS載體，沉默高粱后發現其中5個基因的表達量均發生了下調，病菌侵染后沉默組的抗病性顯著下降，染病癥狀加劇，產生大量的真菌孢子［33］。因此VIGS在對基因家族中共同的特異性基因結構域的沉默，可以破解脅迫相關的復雜信號傳導組分［96-97］，促進了植物在多種脅迫下的基因功能研究。

第四，將病毒載體和最新的功能基因組學工具結合是著眼于當前以及未來的可能發展方向［98］。植 物 中 CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced palindromic repeats）已經成為另一種強大有力的編輯技術［98］。在編輯系統中高效的傳遞載體尤為重要，Ali研究報道稱TRV可以將引導RNA（guid RNA gRNA）傳遞到Cas9穩定表達的轉基因本氏煙中，指導核酸內切酶至目標位點進行精確切割，雖然效率較低但也檢測到了PCNA基因的靶向修飾［99］。Liu開發了一種更強大的基于DNA病毒CaLCuV用于CRISPR/Cas9介導的植物基因組編輯技術（virusbased genome editing，VIGE），精確地靶定 PDS和IspH基因引發突變，其編輯效率高達85%和75%并產生了白化表型。與TRV在細胞質中轉錄不同，CaLCuV可以在基因編輯的細胞核中復制并表達gRNA，所以顯示出了較高的基因編輯效率［100］。這擴大了VIGS和CRISPER/Cas在植物基因組學和農業生物技術中的應用。

植物穩定的遺傳轉化體系中通常都需要植物組織培養和生成愈傷組織，并且林木物種中難以進行遺傳轉化。尋找一種不需要組織培養的轉化方法使后代依然保持著高突變是植物轉基因和基因編輯的主要方向。如果sgRNA可以進入到生殖細胞中，則使用RNA病毒載體就能導致產生更高頻率的可遺傳基因編輯。在2020年6月Ellison等［101］開發了一種植物體內基因編輯的方法，使用TRV病毒攜帶著單向導RNA（single guide RNA，sgRNA）感染進Cas9的轉基因植物中，其中sgRNA與植物體內的FT（flowering locus T）基因融合，FT基因可以在植物體內葉維管束中轉錄后并轉移到莖尖分生組織誘導開花，因此FT可以促進sgRNA進入莖尖分生組織并以較高的效率產生可遺傳的基因編輯［102］。實驗證明65%的后代幼苗基因組中都出現了PDS基因等位突變，并且該系統同時靶向了3個基因座的效率與靶向一個基因座的編輯效率相同，都獲得了在編輯位點發生突變的后代植株。基于TRV載體的VIGS廣泛運用在作物和模式植物的基因功能研究中［28］，其引導基因編輯攜帶可移動的sgRNA在植物中創建可遺傳的基因編輯有助于揭示基因功能，打開通往植物基因功能研究新世界的大門。

從分子生物學和反向遺傳學建立開始，最初生物學家只是開發克隆新的病毒載體，隨著高通量測序的飛速發展科研工作者利用VIGS技術更廣泛的沉默了感興趣的基因，但是沒人在十年前預測出病毒載體可以輔助進行基因編輯，而現在VIGS作為輔助基因編輯工具在功能基因組學和病毒傳遞遺傳中大放光彩。事實上這些轉變證明了人們才剛開始摸索發掘VIGS的無限可能性，新技術推動了極具創新的新穎應用的發展，甚至VIGS還可以運用到非轉基因遞送技術中是運送脂質體納米材料的理想途徑［103］。VIGS作為重要的功能基因研究手段已經迎來了令人振奮的新時代。