活性氧誘發的植物亞細胞間通訊

李陸萍 梁大成

（1.湖北省主要糧食作物產業化協同創新中心，荊州 434025；2.長江大學濕地生態與農業利用教育部工程研究中心/湖北省澇漬災害與濕地農業重點實驗室，荊州 434025）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）在植物正常代謝條件下起著重要作用，可以參與多種信號轉導途徑［1］。植物在生長發育過程中也會遇到干旱、寒冷、鹽堿和重金屬等惡劣環境，為了抵御這些不良環境，植物體內已經形成了一套復雜的應對機制。其中，植物不同亞細胞器中ROS的產生就是對這些刺激和正常發育的響應。當植物體內活性氧積累超出一定量時，就會打破細胞的氧化還原平衡狀態，造成核酸損傷、蛋白質的氨基酸殘基生成羰基衍生物、蛋白分子內部以及分子間發生交聯形成二硫鍵、蛋白質分子的斷裂及金屬酶類的失活以及磷脂的過氧化等。此外，過量的ROS對植物質膜系統造成損傷并最終引起細胞死亡［2-3］。然而植物會通過不同的抗氧化機制改善ROS的損傷，使活性氧始終保持在一個基本無毒的水平，維持細胞的氧化還原平衡狀態［4］。抗氧化機制包括大分子抗氧化物酶類如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸鹽過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等；小分子抗氧化劑如谷胱甘肽、抗壞血酸、維生素C和維生素V/E等；以及硫氧還蛋白系統和谷氧還蛋白系統等機制［5］。越來越多的研究表明，低濃度的活性氧可以作為植物中的信號分子，調節生長發育途徑，控制氧化還原平衡狀態并對病原體和環境脅迫做出防御［6-7］。本文著重介紹不同種類ROS在信號傳導中的作用以及ROS信號在胞內及細胞器間的傳導過程。

1 植物細胞內ROS的種類

植物體內的葉綠體，線粒體，過氧化物酶體以及質膜和質外體中都會存在ROS（圖1）。ROS主要是由單線態氧（1O2）、超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）組成。單線態氧（1O2）通過能量的轉移在葉綠體中產生［8］，主要產生部位是葉綠體中的光捕獲天線復合體（light harvesting antenna complexes，LHC）和 光 系 統 Ⅱ（photosystem Ⅱ，PS Ⅱ）［9］。不同功能的 PS Ⅱ復合物在內囊體中的位置不同，1O2可以在內囊體基粒中心和邊緣部位產生，由于空間上分布差異導致誘發不同的信號傳導途徑［10-11］。1O2半衰期只有 1-4 μs，但它可以在細胞中存活很長時間，可以穿過細胞膜進入細胞外，擴散到可感知的位置［12］。超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）則是在O2被還原成H2O 這一過程中接受電子產生的。和1O2具有一樣的半衰期，壽命相對較短，不易擴散，只能在產生部位起作用。在線粒體、葉綠體、過氧化物酶體以及質外體中都有產生，都是由于O2經過電子傳遞被還原生成的中間產物，隨后被SOD催化生成H2O2［13］。H2O2的半衰期相對較長（1 ms），可以通過膜的擴散在細胞中進行遠距離運輸并觸發特定信號的轉導。H2O2在種子萌發、細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）、衰老、開花、根系發育、氣孔孔徑調節、細胞壁整合、生殖識別、頂端生長等植物發育和生理過程中發揮重要作用［14-17］。·OH 是由 H2O2和 O2·-生成的［18］。它的半衰期只有1 ns，能夠破壞周圍環境中的任何物質并產生更多的自由基，通過催化多糖的斷裂從而引起細胞壁的松弛促進細胞伸長，在繁殖、發芽和生長中起著積極地作用［19-21］。·OH和H2O2在種子發芽和花粉萌發中起著相反的作用，推測不同種類ROS在控制植物生理方面可能存在不同的作用［20，22］。基于·OH的化學性質，在調控生長發育時涉及到的基因調控途徑還不太明確。目前研究最多的是關于H2O2信號的調控。

圖1 ROS產生的亞細胞位點Fig.1 Subcellular sites from ROS

2 植物細胞如何感知并響應ROS

植物局部受到生物脅迫或非生物脅迫時，大量的活性氧會通過細胞壁過氧化物酶體和質膜NADPH氧化酶的作用在質外體中積累［23-25］。而當相鄰的細胞感知到活性氧時，Ca2+通道被激活，進而刺激呼吸爆發氧化酶（respiratory burst oxidase homologs，RBOHs）產生活性氧，再通過相鄰細胞引發長距離信號傳播，從而使整個植株做出響應［26］。植物細胞內部與質外體環境之間的通訊主要依靠類受體蛋白和類受體激酶來調控的。其中，類受體激酶是一類鑲嵌在細胞膜上的跨膜蛋白，延伸到質外體的部分會感知這種刺激，然后通過存在于細胞質內部的區域將信號傳遞到細胞內環境中［27］。最近的研究發現一種含有特定半胱氨酸殘基的蛋白激酶HPCA1（hydrogen-peroxide-induced Ca2+increases）， 由 于 質外體中H2O2的激活形成共價修飾導致自身磷酸化。HPCA1外質體部分具有兩對特殊的半胱氨酸殘基，H2O2通過氧化這種殘基基團引發蛋白構象變化和激酶活性，導致鈣離子通道開放和Ca2+內流，觸發內在的系統信號通路（圖2）［28］。

圖2 H2O2介導的觸發細胞內在信號通路的示意圖Fig.2 A schematic representation of H2O2-mediated triggering intrinsic signaling pathways in cell

3 ROS信號參與細胞器間的交流

細胞器與細胞核存在通訊，大部分細胞器蛋白是由細胞核編碼、翻譯后進入細胞器發揮作用的。相反，一些細胞器的信號可以“逆行”進入細胞核引起核基因表達的變化，從而編碼具有結構和代謝功能的細胞器蛋白，這種調控信號被稱為“逆行信號”。研究表明細胞器中的氧化還原感應和信號轉導都與活性氧有關［29］。ROS的產生可能是調節細胞機制以適應外界環境改變的必要信號，它可以調節多種信號轉導的途徑，最終影響轉錄因子基因的活性［30］。而植物體內的ROS主要是在葉綠體、過氧化物酶體和線粒體中產生的。

3.1 ROS參與葉綠體和細胞核之間的交流

細胞核對葉綠體的功能起著相當大的作用，大部分葉綠體蛋白由細胞核編碼進入葉綠體。相反，一些葉綠體產物作為逆行信號也可以調節核編碼基因的表達，編碼具有結構和代謝功能的葉綠體蛋白［31］。SAL1是一種定位于葉綠體和線粒體的蛋白（圖3），能夠將磷脂酸磷酸酶（phosphoadenosine phosphate，PAP）磷酸化。強光和干旱條件下SAL1的活性受到抑制，導致PAP的積累，從而抑制特定的核酸酶XRNs（exoribonucleases）來激活核基因APX2（Ascorbate peroxidase 2）和 ELIP2（Early light inducible protein 2）的表達［32］。此外，類胡蘿卜素是葉綠體LHC的組成成分，能夠清除PSII反應中心產生的1O2［33］。類胡蘿卜素衍生物最近被提出作為葉綠體產生的信號分子，影響葉綠體活性和核基因表達［34-36］。這兩種逆行信號都會受到葉綠體中ROS介導。葉綠體至細胞核逆行信號的傳導途徑可通過四吡咯生物合成中間體的積累，質體基因的表達，葉綠體氧化還原條件的變化和各種活性氧的積累來激活［37-38］。這些激活的信號通路受到GUN1（Genomeuncoupled 1）和ABI4（ABA insensitive 4）的共同調控［39］。抑制劑林可霉素處理植物時，在光下葉片會在葉綠體中產生1O2，受到GUN1/ABI4途徑的影響，核基因表達降低，表明ROS在GUN1/ABI4依賴性途徑中起作用［40］。葉綠體是植物產生ROS的主要部位，其中PSⅡ和LHC產生的1O2是參與調節PCD的主要物質，它的擴散距離短，能夠與脂質、蛋白質和色素反應，并被水迅速淬滅，推測一些脂質和類胡蘿卜素氧化產物是1O2誘導的逆行信號［41，34］。另外發現兩個核編碼的葉綠體蛋白EX1（Executer1）、EX2（Executer2）以及細胞核拓撲異構酶Ⅵ也參與了該逆行信號［42-45］。葉綠體中ROS還產生于PSI，SOD將電子傳遞產生的O2·-氧化成 H2O2，相對于1O2，H2O2更穩定，可以作為葉綠體中的信號，從細胞器中擴散出來，以轉導細胞質中的信號，以便隨后與其他細胞成分進行信號整合［46］。葉綠體管狀突起的發現，對葉綠體信號通路有了新的認識［47］。這些管狀突起的形成取決于很多因素。植物與病原菌相互作用時，會產生管狀突起使葉綠體和細胞核相連［48］。葉綠體產生的ROS也會導致管狀突起的形成［49］。由此可見葉綠體延伸可以將氧化還原信息直接饋送到細胞核，以進行后續反應。

3.2 ROS參與線粒體和細胞核之間的交流

線粒體中呼吸代謝電子傳遞鏈中產生ROS。在植物中，線粒體至細胞核的逆行信號導致一組特定的核基因表達升高［50］。其中，ROS誘導的轉錄因子ABI4通過與啟動子區抑制因子B順式作用元件結合來調控核編碼的替代性氧化酶AOX1（alternative oxidase 1）的表達［51］，該酶被認為是線粒體到核逆行信號的標志性應答者［47］。此外通過對線粒體應激響應基因的功能分析，在其啟動子中發現了一個典型的基序MDM（mitochondrial dys-function motif），該基序可被NAC轉錄因子感知［52］。當ROS存在時該轉錄因子編碼的蛋白被水解釋放，并轉運到細胞核中，介導線粒體與細胞核的通信［53］。自由基誘發細胞死亡蛋白RCD1（radical-induce cell death1）與來自線粒體復合體III中的ROS相關逆行信號轉錄因子ANAC013和ANAC017相互作用，由于PSI電子受體的缺失，導致葉綠體ROS的改變，而這種改變通過逆行信號傳導影響RCD1的穩定性，當RCD1失活時會導致轉錄因子激活的線粒體功能障礙刺激基 因（mitochondrial dysfunction stimulon，MDS）表達量增加，其蛋白產物選擇性氧化酶AOXs（alternative oxidases）積累，導致葉綠體中ROS減少，影響葉綠體的氧化還原狀態，增加了對光合器的保護（圖3）［54］。RCD1介導線粒體和葉綠體之間的ROS信號通路，進而維持了線粒體和葉綠體的氧化還原平衡。植物正常生長發育，細胞器和細胞核之間的協調是必不可少的，需要組織之間持續不斷的交流，ROS信號通過誘導氧化應激信號激活轉錄因子使核基因的表達編碼蛋白質作用于相鄰的各細胞器。

3.3 ROS參與線粒體和葉綠體之間的信息傳遞

葉綠體向線粒體傳導信號可能是通過調節核基因的表達完成的。線粒體通過MDS基因表達相關蛋白來響應ROS對葉綠體的干擾［50］。相關研究表明擬南芥ABI4同時調控Lhcb（Light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein）和AOX1A（Alternative oxidase1a）基因，連接細胞核協調葉綠體和線粒體的通信［39，51］。在擬南芥中，有許多蛋白同時定位于線粒體和葉綠體中［55］。正是由于蛋白的雙重靶向使得線粒體和葉綠體進行交流。失活的線粒體復合物Ⅰ誘導雙半胱氨酸蛋白定位于細胞質、葉綠體、線粒體，可以將線粒體功能障礙信號傳遞到細胞質，隨后傳遞到葉綠體等其他細胞器［56］。線粒體復合物Ⅰ的失活導致ROS產生，推測ROS在線粒體和葉綠體信號交流之間起著非常重要的作用。此外，水楊酸（salicylic acid，SA）信號在葉綠體和線粒體信號傳遞中也起著重要的作用。SA是在葉綠體中合成的［57］，主要作用于病原體脅迫以及非生物脅迫響應［58］。病原菌誘導的SA主要是通過ICS1（isochorismate synthase1）和 ICS2（isochorismate synthase2）兩種酶合成的［59］。葉綠體中產生的1O2可以誘導EX1和EX2來調節SA水平。外源施加SA可以通過抑制線粒體復合物Ⅲ的活性來誘導線粒體ROS的產生［60-61］。在擬南芥 eds5（enhanced disease susceptibility5）突變體中，由于應激反應誘導的SA不能運輸到葉綠體外［62］。從而推測EDS5在SA從葉綠體運輸到葉綠體外這一過程中起著重要作用（圖3）。植物的線粒體電子傳遞鏈組分中電子載體過度還原產生的ROS作為信號分子會增加線粒體膜的通透性，誘導細胞發生程序性死亡［63-64］。在擬南芥mod1（mosaic death 1）突變體中發現ROS的積累和異常的形態表型，然而通過降低線粒體電子傳遞復合體的活性可以部分恢復葉綠體中由于脂肪酸生物合成缺陷而引起的mod1異常表型，這一研究表明葉綠體中產生的信號可能導致線粒體電子傳遞鏈產生ROS［65］。進一步研究表明，mod1突變體中NADH在葉綠體大量積累，NADH與草酰乙酸在plNADMDH（plastidial nad-dependent malate dehydrogenase）的催化作用下生成蘋果酸，通過DiT1（dicarboxylate transporter 1）運輸至細胞質，再通過蘋果酸-草酰乙酸穿梭系統進入線粒體，在mMDH1（mitochondrial malate dehydrogenase 1）的催化作用下進而導致線粒體中NADH水平升高，誘導線粒體電子傳遞鏈并引發ROS的產生［66］。葉綠體中ROS產生的信號通過蘋果酸穿梭遞到線粒體中激發ROS產生（圖3）。

3.4 ROS參與其他信息傳遞途經

目前所了解的細胞器到核的信號轉導途徑在空間、時間、生理和代謝上是相互聯系的。與葉綠體和線粒體相似，過氧化物酶體中的O2·-是在過氧化物酶體膜中產生的，隨后通過SOD催化生成H2O2。此外，在過氧化物酶體的光呼吸途徑中，乙醇酸氧化酶也會產生H2O2，隨后H2O2通過擴散傳輸到細胞質中發揮作用［67］。在過氧化物酶體中為了保證ROS的動態平衡，CAT也會將過多的H2O2分解。另外，在質膜上產生的ROS在質外體中積累，在植物生長和防御中起著關鍵的作用。研究表明，轉錄因 子 HBI1（homolog of BEE2 interacting with IBH 1）通過差異控制NADPH氧化酶（NOXs）和過氧化物酶（POXs）的表達進而調節質外體中ROS的穩態達到免疫生長平衡［68］。

圖3 ROS介導的細胞器信號轉導Fig.3 ROS-mediated in organelles signaling

總之，H2O2是最穩定的ROS，可以從細胞器轉移到胞質和細胞核，從而導致胞質和細胞核氧化還原狀態的改變，觸發信號網絡，進行信息傳遞。

4 ROS信號在細胞間的作用

植物的正常生長發育是通過細胞和組織之間的通訊交流來協調實現的。胞間連絲是連接植物相鄰細胞的通道，其孔徑的大小是由胼胝質的厚度決定的［69］。研究表明，擬南芥gat1（gfp arrested trafficking1）突 變 體 中，GFP（green fluorescent protein）只在根中的韌皮部中被發現，未能移動到整個根尖，其體內過氧化氫的含量高于野生型，胼胝質也有所增加，推測過氧化氫可能作為信號分子調節胼胝質的生成，從而影響胞間運輸［70］。與之相反的，在擬南芥ise1（increased size exclusion limit 1）突變體中過氧化氫的含量也發生了明顯的升高，但是并沒有降低胞間連絲的運輸能力，GFP在表皮細胞的擴散效率明顯提高，胞間連絲的運輸能力得到增強［71］。由此可見，一定濃度的過氧化氫可以提高胞間連絲的通透性，促進細胞通道連接，但是這個具體濃度還有待明確。目前提出了H2O2通過使細胞壁松弛，使鑲嵌于細胞壁的胞間連絲重建，從而改變了它們的轉運能力［72］。胞間連絲是許多信號傳導的必經之路，包括小分子物質的自由擴散和大分子物質的運輸，如植物病毒運動蛋白、轉錄因子、mRNA等。許多胞內轉錄因子能夠通過胞間連絲進入相鄰的細胞發揮作用，調節植物發育。基因沉默信號在植物內的傳播也是通過胞間連絲來轉運的，H2O2在控制沉默信號移動起著關鍵的作用［73-74］。

5 展望

植物在逐漸適應環境的同時形成了很好的適應機制，這些機制既能發生在植物體受到環境脅迫的組織也能發生在未受環境脅迫的組織，這種系統性獲得性適應（systemic acquired acclimation，SAA）在避免植物受到不利環境危害的過程中發揮著重要作用［75］。ROS作為重要的信號分子參與植物的生長、發育、分化。研究發現，對植物進行一定的體外ROS處理，可顯著改善植物的生長特性，這對植物調節許多生理生化過程有益。植物受到非生物脅迫時產生的氧化還原信號會與植物激素、Ca2+、RNA、MAPK（mitogen-activated protein kinase）等其他信號分子相互作用引起一系列次級信號，從而導致基因表達差異［76-78］，通過不同的信號途徑來維持自身氧化還原平衡。目前對活性氧是如何與其他信號分子相互作用而實現細胞內部信息交流，如何影響細胞通道連接的機制尚不明確，有待進一步深入的研究。