植物磷脂酶C在應答脅迫反應中的研究進展

趙阿慧 王憲國 董劍，2 侯佐 趙萬春，2 高翔，2 楊明明，2

（1.西北農林科技大學農學院，楊凌 712100；2.陜西省小麥新品種培育工程研究中心，楊凌 712100；3.陜西省寶雞市種子管理站，寶雞 721006）

在自然界中，磷脂酶廣泛存在，是一種能在特定酯鍵上水解磷脂底物的酶類，根據其底物中磷脂裂解鍵的位置可分為磷脂酶A1（phospholipase A1，PLA1）、磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）、磷脂酶B（phospholipase B，PLB）、磷脂酶C（phospholipase C，PLC）和磷脂酶D（phospholipase D，PLD）（圖1）［1］。這五種磷脂酶在結構、調節機制和功能上有很大差異，在信號轉導［2］、動植物生長代謝［3-5］、細菌［6］和真菌［7］致病機制等方面也具有多樣作用。其中，磷脂酶C參與動植物以及細菌信號通路，并發揮重要作用［8］。

PLC基因已經在動物、植物、酵母、細菌等多種生物中被鑒定。動物中的PLC基因分為6類和13個亞型，即 PLC-β1-4、PLC-γ1-2、PLC-δ1-5、PLC-ε、PLC-η1-2 和 PLC-ζ［9］。這些 PLC 基因的結構、作用機制、生理功能不盡相同，但它們對動物的生長發育、人類疾病治療等方面都有重要的作用。植物中的磷脂酶C分為特異性磷脂酶C（phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC）和非特異性磷脂酶C（nonspecific phospholipase C，NPC），PI-PLC主要水解磷脂酰肌醇類，生成2個信號分子，參與植物體內生長發育、信號轉導、生物與非生物的脅迫響應及諸多其他功能；NPC的水解產物同樣也能參與到植物的生長調節、介導信號通路及各種脅迫中，值得注意的是它在磷酸鹽短缺中具有重要作用。本文就近年來植物中PLC的分類、結構、生化特性與生理功能研究進行總結，以期為植物PLC基因的功能研究提供幫助。

1 植物磷脂酶C的分類

磷脂酶C是一種重要的水解酶類，與植物的多種生理和抗逆功能有關。磷脂酶C根據其水解磷脂的底物不同，可分為PI-PLC和NPC［10-11］。其中PIPLC主要定位于細胞質膜上［12］，水解4，5二磷脂酰肌 醇（phosphatidylinositol 4，5- bisphosphate，PIP2）產生三磷酸肌醇（inositol 1，4，5- trisphosphate，IP3）和二酰甘油（1，2-diacylglycerol，DAG），DAG和IP3作為第二信使，在信號轉導和級聯擴大中起著重要作用［13］。同時，該基因受Ca2+的調控，在植物發育的不同的器官和組織、不同階段，以及在各種非生物脅迫和生物脅迫條件下都有不同的表達模式。NPC可以水解磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）等物質，從而生成DAG和頭部帶有磷酸基團的小分子化合物，在干旱、高鹽、低磷等非生物脅迫下發揮重要作用［14-15］。目前，擬南芥基因組中有9個PI-PLC基因和6個NPC基因［16］，水稻基因組中有4個PIPLC基因和5個NPC基因［2，17］，番茄基因組中有6個PI-PLC基因，楊樹基因組中有7個PI-PLC基因［18］，小麥基因組中有11個PI-PLC基因和15個NPC 基因［19］。

2 磷酸肌醇特異性磷脂酶C

2.1 磷酸肌醇特異性磷脂酶C的結構

PI-PLC的催化結構域X和Y兩側均有調控序列［20］（圖2）。X、Y催化結構域和EF手型結構域在動植物中共有。所有PI-PLC的催化活性依賴于X、Y結構域，它們是磷脂酶C最保守的2個結構域。EF手型結構域由2-4個螺旋折疊的序列組成，可與底物和Ca2+結合，植物PI-PLC中只有后2個EF結構域，是否能與鈣離子結合的機制有待進一步研究［21］。在植物應答外界生物脅迫的過程中，EF手型結構域還具有調控還原型輔酶Ⅱ氧化酶RBOHD的功能［22］。植物PI-PLC結構的最大特點是沒有pleckstrin同源結構域（pleckstrin homology domain，PH 結構域），與動物中 PLC-ζ的結構相似［23］。C2結構域是PI-PLC都具有的一個結構域，它與Ca2+結合，引起磷脂酶C疏水性發生變化，并能優化膜催化核心的磷脂水解率［24］；C2結構域還選擇性地去結合磷脂，如磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、 磷 脂 酰 膽 堿（phosphatidylcholine，PC）和PE［25］。

2.2 磷酸肌醇特異性磷脂酶C的生化特性

PI-PLC對質膜起著至關重要的作用。PI-PLC的首選底物是PIP2，其次是磷脂酰肌醇磷酸酯（phosphatidylinositol phosphate，PIP），然后是磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）。PIP2斷裂產生DAG和IP3，DAG激活鈣依賴性蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）［20，26］，然后磷酸化下游效應器，激活一系列細胞功能，包括調節細胞增殖、細胞極性和信號的空間分布。IP3是一個水溶性的小分子，它從細胞膜向外擴散，并通過胞質溶膠誘導胞內儲存的Ca2+從內質網中釋放出來。反之，細胞質中的Ca2+水平迅速升高，引起細胞信號激活的特征性鈣峰。一旦內質網儲備耗盡，它們就會通過儲備的鈣通道補充。Ca2+激活下游轉錄因子，進而激活多種基因的調控通路。PI-PLC信號通路可以調節植物細胞增殖、分化、受精、細胞分裂、生長以及基因表達的改變。

圖2 PLCs 結構域簡圖Fig.2 PLCs domain diagram

高等植物PI-PLC屬于PLC-ζ類，缺乏G蛋白調控的PLC-β或者PLC-ε型中的保守序列。PI-PLC通常被認為水解PIP2，產生IP3，通過配體門控受體釋放細胞內Ca2+。然而，植物缺乏這種受體，并且與哺乳動物細胞相比，表現出極低的PIP2水平。同時植物基因組中缺乏PKC的同源序列，所以沒有證據表明DAG在信號傳導中起作用［27］。相比之下，有大量證據表明磷脂酸在植物中起著信號轉導作用。植物中的DAG在鹽、低溫、高滲透等非生物脅迫和微生物病害等生物脅迫下被二酰甘油激酶（DAG kinase，DGK）磷酸化生成PA，而PA可以促進植物對逆境脅迫進行響應［16，28］。類似地研究證明，植物在受到干旱、脫落酸（abscisic acid，ABA）等非生物脅迫后，PA生成量有所增加，而PA是PI-PLC的特異性水解產物，所以間接證明PI-PLC有促進植物抵抗外界非生物脅迫的能力［29］。然而植物PIPLC及其反應產物的確切作用是什么，仍需要進一步研究。

2.3 磷酸肌醇特異性磷脂酶C的生理功能

據報道，PI-PLC參與了多種細胞發育和信號轉導途徑，以響應干旱、高鹽、低溫和高溫等非生物脅迫和生物脅迫。如小麥、水稻、玉米、煙草、馬鈴薯、番茄和擬南芥等受生物脅迫及非生物脅迫過程中，一些PI-PLC基因的表達顯示上調或下調。另外，研究發現，增加特定的PI-PLC基因表達量也可以顯著改善植物對鹽、干旱及激素等的耐受性。因此，PI-PLC基因是未來產生耐逆高產作物品種的潛在遺傳操作候選基因。

2.3.1 非生物脅迫

2.3.1.1 滲透脅迫 NaCl/KCl和甘露醇、山梨醇等滲透脅迫誘導劑引起IP3水平在短時間內快速升高，并在抗滲透脅迫方面具有積極作用［30-32］。Deng等［33］發現水稻OsPI-PLC4影響滲透脅迫誘導的PA、IP3和Ca2+等含量的變化，并積極調節水稻對鹽和干旱的反應。在植物滲透脅迫期間，會快速觸發Ca2+信號，這可能會激活SOS（鹽過度敏感）途徑，將Na+擠出細胞，從而減少細胞質中有毒Na+的數量。這表明OsPI-PLC1通過調節鹽脅迫誘導的Ca2+信號的形成而促進水稻的耐鹽性。同時，在鹽脅迫的條件下，水稻和擬南芥中PI-PLC基因的表達量會增加［34］。其中，AtPI-PLC1參與不依賴ABA的高滲脅迫信號轉導；AtPI-PLC2參與內質網脅迫反應和生長素調節的生長發育；AtNPC4可以提高擬南芥對高滲透脅迫的抗性［35］。

脯氨酸是一種滲透調節物質，在植物體內積累以減輕滲透脅迫作用。在擬南芥中，PI-PLC水解產生IP3調節鈣離子釋放，隨后導致脯氨酸積累，以響應鈣離子，而非離子高滲脅迫［36］。然而，在鹽和滲透脅迫條件下，PI-PLC對細胞滲透壓水平有積極的影響［37］。ABA是一種重要的植物應激激素，在脅迫下積累，控制許多植物防御反應［38-39］。在植物中，PI-PLC似乎積極參與ABA依賴的信號傳遞，如AtPI-PLC6可以被ABA誘導表達上調，AtPI-PLC6、AtPI-PLC7和AtPI-PLC8的表達量可以被生長素、細胞分裂素、鹽脅迫、干旱脅迫和冷脅迫誘導上調表達［16，40］。

2.3.1.2 低溫脅迫 磷脂酶是將磷脂水解成脂肪酸或親脂物質的酶。它們通過改變質膜脂質成分影響低溫和抗凍性［41］。在低溫脅迫下，植物中幾種基于磷脂的信號途徑被迅速激活。這些途徑包括PLD和PLC與DGK（PLD&PLC/DGK）結合，直接或間接導致PA的產生［28］。近年來，PA已被確認為是參與調節植物、動物和真菌細胞生長、發育和應激反應的重要細胞介質［42-44］。PA包含一小類膜脂，其中磷酸甘油與2個脂肪酸鏈酯化。PA的含量和分子形式對植物的抗寒性和抗凍性有重要影響。在ABA處理的擬南芥葉片中，PA的含量增加了大約50%［45-46］，而在冷凍過程中，擬南芥葉片中的PA水平升高了5倍以上［47］。此外，徐小靜等［48］通過冷脅迫處理擬南芥幼苗發現，AtPI-PLC6 mRNA的轉錄受到冷脅迫的誘導，AtPI-PLC6可能參與了植株對冷脅迫的響應；玉米中ZmPI-PLC5在低溫脅迫下表達量上調［49］。

2.3.1.3 干旱脅迫 鈣調蛋白、G蛋白、PLC、PLD及蛋白激酶等間接參與水分脅迫的信號轉導，從而起到應對干旱脅迫的作用［50-51］。當在干旱脅迫或者鹽脅迫下，小麥TaPI-PLC1［52］、綠豆VrPIPLC3［53］、煙草 NtPI-PLC1、馬鈴薯 StPI-PLC1 和 StPIPLC2［54］等基因上調或下調表達。也有研究表明干旱脅迫下，PI-PLC和肌醇六磷酸（inositol 6-phosphate，IP6）參與ABA信號傳遞和調節氣孔開閉［55］。擬南芥中的AtPI-PLC2通過控制水楊酸（sclicylic acid，SA）和茉莉酸甲酯（jasmonic acid，JA）的含量控制PA的生成，進而抵抗干旱脅迫［56］。

2.3.1.4 熱脅迫 高溫對植物的生長發育造成嚴重影響，在熱脅迫下，細胞膜流動性和鈣離子信號途徑和產地高溫信號密切相關，這些信號的傳導成為耐熱性的關鍵步驟。在熱激反應中，IP3與受體結合引起鈣離子濃度瞬間變化，并通過一系列途徑使熱激轉錄因子激活熱激蛋白的表達，進而參與植物對高溫脅迫的適應［57］。在豌豆中，熱脅迫激活PLC的表達并且與水楊酸共同參與耐熱調控［58］。在番茄中，熱處理后，PLC3和PLC6顯著上調表達［7］。AtPLC3和AtPLC9在擬南芥中參與耐熱中的作用也被報道［57，59］，AtPLC3缺失突變體熱處理 1 h后，與野生 型 相 比，AtHSP18.2、AtHSP25.3、AtHSP70-1和AtHSP8-3均下調表達30%，而在AtPLC3過表達的轉基因擬南芥中，4個蛋白的表達均提高1.5-2.0 倍，表明PLC3基因可能是通過調節HSP的表達來提高擬南芥的耐熱性［60］，敲除AtPLC9使擬南芥耐熱性降低，而過表達AtPLC9可以進一步提高擬南芥的耐熱性，同時敲除AtPLC3和AtPLC9與單突變體相比會進一步降低擬南芥的耐熱性［59］。小麥分子生物學實驗室前期研究結果發現，小麥在熱處理下，小麥PLC基因的表達量顯著提高，在PLC蛋白抑制劑U73122處理下，PLC基因的表達量降低，小麥幼苗對熱脅迫的敏感性增強［61］。而關于PLC基因參與的耐熱調控機制，可能是通過改變鈣離子濃度，進一步調控熱激轉錄因子與熱激元件的結合活性，從而影響熱激蛋白的合成和表達［34］。

2.3.1.5 其他脅迫 在植物中，還有一些脅迫信號通過PI-PLC途徑在植物細胞中傳遞。低氧誘導水稻根系快速積累與G蛋白無關的IP3。這種PLC的激活通過IP3敏感的鈣通道、鈣離子和鈣調素進一步傳遞，這些鈣離子和鈣調素是在厭氧脅迫期間γ-氨基丁酸積累和細胞鉀流失所必需的［62］；在鋁處理后的咖啡懸浮細胞中，能快誘導IP3積累［63］，油菜根體內銅過量能迅速增加DAG的積累［64］，而IP3和DAG間接反映PI-PLC的活性。

2.3.2 生物脅迫 植物固有免疫使植物對潛在的傳染性病原體（病毒、細菌和真菌）有抵抗力。激活植物防御的免疫原性信號有多種形式。磷脂酶和磷脂衍生分子被認為是免疫防御形式的內在組成部分［65-67］。

在生物脅迫下，PI-PLC基因的轉錄激活是常見的。在番茄中，一些PI-PLC基因家族成員被確定為植物防御系統的關鍵組成部分［7］，SlPI-PLC4和SlPI-PLC2表達量下調，則損害木聚糖酶的功能［68-69］。在生物脅迫條件下，SlPI-PLC4和SlPI-PLC6對番茄抗黃曲霉菌、大麗花黃萎病菌和丁香假單胞菌的過敏反應和植株抗性的發生具有顯著的調控作用。在擬南芥中，AtPI-PLC2突變體的根對衣霉素誘導的內質網應激反應更加敏感［55］。以上結果都表明PI-PLC參與了植物對生物脅迫的響應。綜上所述，植物PIPLC在響應不同脅迫的信號轉導中發揮著重要作用，是細胞調控系統復雜網絡中的一個關鍵中樞。然而，PI-PLC基因在非生物和生物脅迫響應中的作用機制等尚需進一步研究。

3 非特異性磷脂酶C

3.1 非特異性磷脂酶C的結構

當植物NPC首次被發現時，它們與任何其他已知的植物磷脂酶家族成員沒有關系。通過比對擬南芥NPC與結核分枝桿菌PLC，發現3個與已知植物磷脂酶區域無關的保守區域［14］。雖然NPC亞家族在進化中出現得很早，但細菌、植物和無脊椎動物的譜系都有各自不同的NPC序列特征。NPC蛋白雖然沒有其他植物磷脂酶家族成員含有的C2、X、Y、EF-hand等結構域，但它包含一個中心磷酸酯酶結構域，該結構域通常存在于具有酯酶活性的酶中，如NPC和酸性磷酸酶，可以水解磷脂，因此，NPC被歸為PLC的一個亞家族［70］。

3.2 非特異性磷脂酶C的生化特性

NPC是PLC的一種亞型，它能水解一系列膜磷脂［71］，如磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油和磷脂酸［72］，并生成DAG和帶有磷酸基團的頭部。NPC首先在致病細菌Cl.welchii中發現［73］，它具有卵磷脂酶C一樣的活性，能導致宿主細胞質膜溶解。因此，NPC也被稱為PC-PLC，但細菌PI-PLC屬于分泌性致病因子，且通常具有毒性［74］。隨后NPC作為具有信號功能的新型磷脂酶在植物歐芹和煙草細胞中被鑒定［75］。與PI-PLC只用PIPs作為底物不同，NPC的底物廣泛，主要是膜磷脂類，如PC和PE作為底物，不水解PIP2。AtNPC4和AtNPC5的重組蛋白表明PLC對PC和PE的活性［76］。同樣，最近克隆的AtNPC2和AtNPC6對PC和PE的活性幾乎相同［77］。對AtNPC2、AtNPC4和AtNPC6進行了PA水解測試，但均未顯示出顯著的磷酸酶活性［77-78］，這表明NPC是一種磷酸二酯酶。然而，AtNPC3被證明具有PA磷酸酶的功能，盡管其氨基酸序列與其他NPCs高度同源［79］。值得注意的是，水稻OsNPC1被證明用PC和雙半乳糖基甘油二酯（digalactosyldiacylglycerol，DGDG）作為底物［80］。另外，Cai等［81］表明在擬南芥中 AtNPC6 水解單半乳糖二酰基甘油（monogalactosyldiacylglycerol，MGDG）和DGDG。因此，需要進一步的生化和酶學研究來闡明底物特異性的分子機制。

3.3 非特異性磷脂酶C的生理功能

NPC活性在干旱、低溫等非生物脅迫以及生物脅迫下會發生變化。在植物細胞中，對Al、油菜素類固醇和激發子的反應，NPC活性和DAG的產生發生了快速變化。在快速啟動子的控制下，這些反應比從頭合成蛋白質要快［82］。NPC活性的變化可以歸因于通過翻譯后修飾或細胞內易位刺激預合成的酶。因此，NPC在植物細胞中具有一定的生理作用。

3.3.1 非生物脅迫 棉花GhNPC3僅在鹽脅迫下優先表達。水稻中OsNPC2對鹽更敏感，在鹽脅迫下其表達量增加了近8倍。擬南芥在鹽脅迫下幼苗根中NPC4表達量增加了12倍，提高了NPC活性以增加DAG的產量［83-84］。此外，在鹽脅迫和高滲透條件下，過表達AtNPC4的轉基因株系具有較高的萌發水平，并能保持更大的根長和干重［71，85］。AtNPC5-1突變體在輕度鹽脅迫（75 mmol/L NaCl）下產生的側根較少［86］。因此，NPC5可能參與了輕度鹽脅迫下側根的發育。

擬南芥幼苗在37℃熱脅迫處理2 h后，AtNPC3的表達水平增加14.6倍［87］，表明NPC在植物耐熱性方面起著重要作用。AtNPC1缺失突變體顯示基礎耐熱性受損，而與野生型相比，AtNPC1的過表達增強了植株對高溫脅迫的抵抗力［88］。在熒光PC培養的煙草By-2細胞中，熱脅迫增加了熒光DAG的產生，這表明NPC活性是由熱脅迫誘導的。棉花GhNPC5和GhNPC9在高溫脅迫下被強烈誘導［89］。以上發現為理解NPC在熱應激反應中的潛在作用提供了一些線索。

鋁的毒性可通過細胞膜去極化、破壞離子通量和鈣穩態快速抑制根系生長，并影響細胞骨架［90-91］。某些磷脂酶和脂質中間體在鋁脅迫中起信號傳導或代謝作用［92］。煙草By-2經過Al處理過后其細胞中DAG積累的減少依賴于NPC活性，表明DAG在鋁脅迫中發揮了重要作用［93］。

NPC與PLC最大的不同在于NPC對磷酸鹽短缺的響應。在磷酸鹽短缺時，有機磷酸鹽可以從膜磷脂中被動員，膜磷脂吸收了植物細胞中1/3的磷。NPC能夠通過將含磷酸鹽的頭基團從磷脂酰膽堿或其他磷脂中分離來促進這種活動［94-95］。在磷酸鹽缺乏的情況下，擬南芥中PC含量的短暫增加伴隨著DAG的快速下降，表明AtNPC4被激活［96］。AtNPC4在缺乏磷酸鹽的擬南芥中得到了較高的表達［14］。AtNPC5表達量增加，T-DNA突變體的AtNPC5在磷酸鹽缺乏期間DGDG積累減少，PI缺失導致擬南芥根中的NPC5特異性激活［97］。有趣的是，雖然AtNPC4和AtNPC5的表達水平在磷酸鹽饑餓期間被顯著誘導，但磷酸鹽攝取的恢復導致其轉錄被快速抑制［98］。AtNPC3敲除突變體表現出了由磷酸鹽缺乏誘導的側根生長的弱損傷［99］。植物NPC無疑出現在磷酸鹽限制條件下的脂質重塑的關鍵酶中。

3.3.2 生物脅迫 磷脂酶在植物應對生物脅迫調節機制中起著重要作用［100］。Scherer等［75］分別研究了大豆疫霉菌糖蛋白誘導子和煙草隱球菌誘導子在香菜細胞系和煙草細胞系中的作用，首次證明了NPC誘導子可能在植物防御反應中的信號轉導作用。在2個脂肪酸殘基上添加合成的PC熒光標記到細胞培養物中，發現熒光標記的DAG產量迅速下降，表明NPC活性受到抑制。在使用mastoparan（一種能夠激活G蛋白的肽）治療后，DAG水平也出現下降。觀察到的熒光標記PA水平不顯著，說明熒光DAG主要來源于NPC的直接作用，而不是PLD和PAP（PA phosphatase）的激活［70，75］。

不同菌株的丁香假單胞菌和寄生假單胞菌接種后，AtNPC基因家族（特別是AtNPC6）顯著下調，這代表了兼容和不兼容的植物-病原體相互作用［70］。然而，AtNPC3和AtNPC4對灰霉病、灰霉病、丁香假單胞菌和疫霉菌侵染有陽性反應［16，99］。AtNPC5的同源基因在侵染亞洲念珠菌后的柑桔植株中表達量增加了4倍［98］。此外，AtNPC1和AtNPC4對細菌來源的激發子（flg22和HprZ）有反應，這表明NPC在應激反應和感知不同激發子的能力中可能具有二價功能［71］。在擬南芥突變體中，煙粉虱感染期間和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）處理后，AtNPC3表達均升高，表明AtNPC3可能參與了對害蟲的防御反應［70］。

4 展望

從植物PLC的結構來看，植物與動物PLC中最簡單的PLCζ結構相似，缺少除EF-hand、XY保守域和C2域以外的結構域，且EF結構只有2個螺旋折疊的序列，但在動物里都有4個（除PLCζ），植物缺少的PH結構域，在與底物結合時有重要作用；從調節機制看，植物中沒有發現IP3受體，也沒有發現DAG能夠激活特異性的的蛋白激酶，大量研究表明其下游產物PA是響應鹽、高滲、干旱等非生物脅迫的關鍵產物；植物中的調節機制有待進一步研究，PLC水解產生的DAG與IP3與下游的PA及Ca2+之間的直接聯系尚待進一步研究證明，Ca2+能否直接激活PLC發揮作用也沒有證據表明，且PA的功能結構域也并沒有完整定義，還有些人認為PA和IP6是植物體內的二級信使，具體機制也有待研究。這些方面的探究對于PLC的深入挖掘具有重要意義，一方面能填補PLC在這些領域的空白；另一方面也能為高效優質育種做出貢獻。