藏羊皮膚組織中低氧促有絲分裂因子的表達及分布研究

趙曉萌，買雨晨，周 宇，喬自林,2,3，楊 琨,2,3*

(1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730100；2. 西北民族大學生物醫學研究中心甘肅省動物細胞技術創新中心；3.西北民族大學生物醫學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室)

藏羊作為我國三大原始綿羊品系之一[1]，主要分布于青藏高原地區，其獨特的地理因素使藏羊具有較高的通氣量、血氧飽和度以及較低的肺動脈壓和血紅蛋白等特點[2]。且藏羊皮膚覆蓋于整個機體體表，具有保護深部組織免受外界機械刺激、光化學輻射及抵御寒冷的作用，是研究高原生物低氧適應性的良好材料。

低氧促有絲分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor，HIMF)又稱炎癥區1(found in inflammatory zone 1，FIZZ1)或抵抗素樣分子-α(resistin-like molecule α，RELMα)，是抵抗素樣分子(resistin-like molecule/found in inflammatory zone,FIZZ/RELM)家族的一員[3]，該家族由FIZZ1/RELMα/HIMF，FIZZ2/RELMβ，FIZZ3/resistin和RELMγ組成[4]。其中低氧促有絲分裂因子始終以單體形式存在，其啟動子區域受多個炎癥相關轉錄因子調控，參與炎癥反應調控、促進血管形成及收縮、促進細胞凋亡、介導骨髓細胞趨化等生物學功能[5-6]。

本研究以藏羊皮膚作為實驗材料，應用蘇木精-伊紅染色法和免疫組織化學法的方法來探究藏羊皮膚組織中低氧促有絲分裂因子的表達及分布情況以及低氧促有絲分裂因子對高原動物低溫耐氧的作用，旨在進一步為低氧促有絲分裂因子對高原動物適應低氧性的機制提供理論依據，具有高度的研究價值和創新意義。

1 材料與方法

1.1實驗動物 采取位于甘肅省臨夏回族自治州自然放養藏羊的健康皮膚組織。經宰割后迅速將藏羊皮膚的蘇木精-伊紅染色樣本和免疫組化樣本放于4%的多聚甲醛中固定。

1.2實驗試劑 0.01 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液、0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液、兔多克隆抗體HIMF、免疫組化試劑盒(SP-0023)、DAB顯色試劑盒(DA1015-3)，均來自于北京博奧森生物技術有限公司。

1.3HE染色及免疫組化SP染色 藏羊皮膚樣本經乙醇濃度梯度脫水、石蠟包埋后，切成厚7 μm的石蠟切片，進行HE染色觀察其組織結構的特點并應用免疫組織化學染色方法對切片進行檢測。具體的HE染色及免疫組化SP染色方法依據說明書操作。

1.4圖像采集及結果判定 藏羊皮膚切片于顯微鏡照相系統下采集圖像。免疫組化染色結果依據著色程度深淺及著色面積判定。若低氧促有絲分裂因子在胞漿、胞核呈現深棕黃色或黃褐色則為強陽性表達，若棕黃色較淺則是弱陽性表達，處于強陽性與弱陽性之間是中性陽性表達，未出現棕黃色或與背景色相似的則為陰性表達。

2 結果與分析

2.1藏羊皮膚的組織學結構 青海藏羊的皮膚組織學結構與其它家畜的相似, 主要由表皮、真皮和皮下組織三部分組成[7]。其中初級毛囊較為粗長，從內向外依次包括毛髓質、毛皮質、內根鞘小皮、內根鞘、外根鞘、纖維鞘等結構，并伴有皮脂腺，其皮脂腺分泌部為幾個實心的細胞團，細胞較大且胞質著色較淺，毛囊之間含有較多膠原纖維，次級毛囊較初級毛囊比細而小，且三毛群和一毛群數量較多(圖1)。

圖1 藏羊皮膚組織切片的HE染色法結果

2.2免疫組織化學表達 根據免疫組化表達陽性顏色的深淺可知，低氧促有絲分裂因子在藏羊皮膚的角質層呈棕黃色的強陽性表達，在初級毛囊和次級毛囊的外根鞘、內鞘小皮中有大量的陽性著色，為集中的陽性表達，在毛根呈現少量陽性表達，在藏羊的表皮和真皮中均未見表達(圖2)。

圖2 藏羊皮膚HIMF蛋白免疫組織化學檢測結果

3 討論

藏羊皮膚覆蓋于整個機體體表，在高原的低溫缺氧環境下最先進行代償，作為氧感受器參與全身低氧反應調節[8]。

HIMF作為一種低氧時小鼠肺組織分泌的分泌物為促成有絲分裂因子，在老鼠表皮角質形成細胞和皮脂細胞中表達[9]，本研究則發現低氧促有絲分裂因子在藏羊皮膚的角質層、初級毛囊和次級毛囊的外根鞘、內鞘小皮以及毛根中存在表達，二者之間相互關聯。據研究表明，抵抗素樣分子在人類皮膚的免疫防御中具有重要作用，且這項研究揭示了抵抗素樣分子基因多態性與在皮膚(如尋常痤瘡和化膿性汗腺炎)中的作用[10]。然而若缺乏低氧促有絲分裂因子，皮膚的微生物群則會發生改變，有學者就利用了CRISPR/Cas9介導的基因，靶向敲除小鼠的Retnla基因位點，驗證了Retnla小鼠皮膚中不存在促有絲分裂因子的結論[9]。

低氧促有絲分裂因子具有促進細胞增殖、遷移、分化、趨化、收縮血管及促進血管新生等功能[11-12]，兼有炎癥因子和生長因子的共同特性且受多個炎癥相關轉錄因子調控。如低氧促有絲分裂因子能夠作為小鼠傷口中交替激活的巨噬細胞介導Plod2[12]，在IL4Rα介導的巨噬細胞賴氨酸羥化酶(lysyl hydroxylase2, LH2)的產生過程中發揮作用，使敲除IL4Rα基因的組織產生不良預后的作用[13]，IL-4和IFN-γ共同調節巨噬細胞FIZZ1的表達[14]，以及可以誘導HIF-1α在肺部的表達、誘導新生血管形成，通過依賴HIF-1α的信號通路上調VEGF及下調VEGFR2的表達等[15]。

本試驗得出低氧促有絲分裂因子在藏羊皮膚的角質層呈現高度表達的狀態，在初級毛囊和次級毛囊的外根鞘、內鞘小皮中呈中度表達、在毛根呈現少量表達的結果，表明二者存在一定關系，低溫缺氧能刺激低氧促有絲分裂因子在皮膚中的表達，對藏羊的生長發育起調節作用，但其具體的表達機制有待進一步研究。

4 結語

蘇木精-伊紅染色結果表明藏羊皮膚組織由表皮、真皮、皮下組織三部分構成。通過免疫組化技術發現低氧促有絲分裂因子在藏羊的表皮、真皮中均未表達，在藏羊皮膚的角質層呈棕黃色的強陽性表達，在初級毛囊和次級毛囊的外根鞘、內鞘小皮中呈集中的陽性表達，在毛根呈現少量陽性表達。根據低氧促有絲分裂因子促進藏羊皮膚組織表達的結果得出在低溫缺氧的條件下藏羊皮膚能夠表達低氧促有絲分裂因子的特性，進而推測低氧促有絲分裂因子對高原動物低溫缺氧適應性起著重要調節作用。