乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p的表達及臨床意義

黃心瑜，林小龍，王健寶

乳腺癌是世界范圍內第三常見惡性腫瘤，也是女性最常見的惡性腫瘤[1]。乳腺癌起源于導管或小葉內襯的上皮細胞，是一種高度異質性的惡性腫瘤[2]。分子生物學及影像學技術的發展使乳腺癌的早期診斷和靶向治療方法得到很大改善，但目前乳腺癌尚無有效的治療方法，復發及轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因[3]。因此，深入研究乳腺癌的發生和發展機制，尋找抑制腫瘤復發及轉移的有效方法，對于改善患者的臨床預后至關重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是具有200個以上核苷酸的非編碼RNA，大量研究證實LncRNA表達失調與癌癥的進展密切相關[4]。LncRNA ADAMTS9-AS1編碼基因位于3p14.1。有研究表明，LncRNA ADAMTS9-AS1在結直腸癌、前列腺癌中表達顯著下調，ADAMTS9-AS1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制大腸癌細胞的生長和增殖，是潛在的診斷生物標志物[5-6]。微小RNA-513a-5p(miR-513a-5p)編碼基因位于Xq27.3。相關研究表明，miR-513a-5p在胃癌、膀胱癌等惡性腫瘤中表達顯著上調，還能夠靶向抑制下游抑癌基因如p53、ZFP36等的表達，促進腫瘤的惡性進展[7-8]。Fang等[9]在體外實驗中表明，LncRNA ADAMTS9-AS1能夠與miR-513a-5p相互作用，促進乳腺癌細胞的增殖及轉移。但二者在判斷乳腺癌臨床預后中的價值尚未完全揭示。本研究通過分析乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1及miR-513a-5p的表達情況，探究二者與臨床病理資料及預后的關系，為臨床預后判斷提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年8月—2017年8月在我院住院治療的乳腺癌患者83例為研究對象。①納入標準：乳腺癌均經病理學檢查明確診斷；均為初次診治，行乳腺癌根治術治療；臨床相關資料齊全，患者無精神障礙性疾病能夠配合治療及隨訪。②排除標準：合并乳腺良性疾病，如乳腺增生、急性乳腺炎等；伴有肺癌、結直腸癌等惡性腫瘤，或具有抗腫瘤治療病史者；伴自身免疫系統疾病、免疫功能缺陷者。本組均為女性；年齡34～67(59.3±2.7)歲。月經情況：絕經前41例，絕經后42例；病理類型：浸潤型導管癌62例，非浸潤型導管癌21例；組織學分級：Ⅰ～Ⅱ級51例，Ⅲ級32例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ期22例；淋巴結轉移：有40例，無43例；腫瘤直徑：<3 cm者39例，≥3 cm者44例；三陰性乳腺癌：是25例，否58例。本研究符合赫爾辛基宣言原則，經醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2研究方法 實時定量PCR檢測乳腺癌及癌旁組織(距癌組織2 cm以上)的LncRNA ADAMTS9-AS1及miR-513a-5p表達情況。各取100 mg組織，加入Trizol裂解液，在冰上研磨，離心去除組織碎片取上清。Trizol法提取組織RNA，分光光度計測定RNA純度。按Takara反轉錄試劑盒實驗步驟將RNA反轉錄為cDNA。PCR的總反應體系為10 μl：cDNA 0.2 μl、2×SYBR Green Premix 5 μl、正反向引物1 μl、雙蒸水3.8 μl。程序為95℃預變性5 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，變性、退火和延伸共40個循環。LncRNA ADAMTS9-AS1的正向引物序列：5'-CTCAGACCACAACTCTCCACCTTG-3'，反向引物序列：5'-CAGATGCTGCCTGGCTGATGG-3'；GAPDH正向引物序列5'-GTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向引物序列：5'-GTTGAGGTCAATGAAGGG-3'。miR-513a-5p正向引物序列：5'-TAAATTTCACCTTTCTGAGAAGG-3'，反向引物序列：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；U6正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。應用2-ΔΔCt法對LncRNA ADAMTS9-AS1及miR-513a-5p相對表達量進行計算。分別以LncRNA ADAMTS9-AS1及miR-513a-5p相對表達量的平均值0.601、1.721為界，分為高表達組和低表達組。

1.3觀察指標 比較乳腺癌及癌旁組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p的表達情況，并分析二者的相關性。在線生物信息學軟件LncBase Predicted v.2(http://carolina.imis.athena-nnovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=lncbasev2/index-predicted)分析LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p相互作用位點[10]。分析LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達與臨床參數的關系，分析二者表達對乳腺癌患者預后的影響及影響預后的危險因素。

2 結果

2.1LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達情況 乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達分別為0.604±0.089、1.714±0.256，癌旁組織中分別為1.613±0.275、0.411±0.069。與癌旁組織比較，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1的表達顯著降低，而miR-513a-5p的表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 乳腺癌與癌旁組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達情況

2.2乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p表達的相關性及相互作用位點預測 Pearson相關分析結果顯示，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p表達呈顯著負相關(r=-0.611，P<0.001)。見圖2a。在線生物信息學軟件LncBase Predicted v.2預測結果顯示，LncRNA ADAMTS9-AS1序列中第273～298位的堿基位置處含有與miR-513a-5p互補結合的核苷酸位點。見圖2b。

圖2 乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p表達的相關性及相互作用位點預測

2.3乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達與臨床參數的關系 乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達與乳腺癌患者的腫瘤分期及淋巴結轉移有相關性，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。二者表達與乳腺癌患者的年齡、月經情況、腫瘤大小、病理類型、組織學分級及是否三陰性乳腺癌無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達與臨床參數的關系

2.4乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達對患者預后的影響 本研究對所有乳腺癌患者隨訪2～36(32.6±2.2)個月。隨訪過程中患者死亡16例，3年總體生存率(overall survival, OS)為80.7%(67/83)。LncRNA ADAMTS9-AS1低表達組和高表達組的3年OS分別為65.9%(27/41)、95.2%(40/42)，生存時間分別為(30.5±2.0)個月、(34.6±2.3)個月。LncRNA ADAMTS9-AS1低表達組的3年OS和生存時間均顯著低于高表達組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3a。miR-513a-5p低表達組和高表達組3年OS分別為92.5%(37/40)、69.8%(30/43)，生存時間分別為(34.9±2.5)個月、(30.8±2.2)個月。miR-513a-5p高表達組的3年OS和生存時間均顯著低于低表達組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3b。

圖3 LncRNA ADAMTS9-AS1、miR-513a-5p表達對乳腺癌患者3年總體生存率的影響

2.5影響乳腺癌患者預后的多因素Cox回歸分析 對相關因素進行賦值：淋巴結轉移(有=1，無=0)、腫瘤分期(Ⅲ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0)、LncRNA ADAMTS9-AS1(低表達=1，高表達=0)、miR-513a-5p(高表達=1，低表達=0)。Cox回歸分析結果顯示，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1低表達、miR-513a-5p高表達、高腫瘤分期及伴有淋巴結轉移是影響乳腺癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 影響乳腺癌患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在腫瘤特異性死亡中居第二位，僅次于宮頸癌。近年來，我國乳腺癌的發病率呈逐漸升高的趨勢，嚴重威脅女性身體健康[11]。目前,乳腺癌的治療包括手術、放化療、激素及靶向治療等，特別是早期篩查技術、基因檢測、靶向治療及個體化治療的發展，使乳腺癌患者的無進展生存時間和總體生存時間得到顯著延長[12-13]。因此，研究能夠反映乳腺癌患者治療反應預測及預后評估的指標，并用于指導臨床決策，是乳腺癌的研究熱點及方向。

LncRNA是近年來發現的一類表達廣泛的非編碼RNA，長度>200 nt，由于LncRNA具有相對穩定的結構，其功能與其他非編碼RNA有所不同，細胞質中的LncRNA主要通過吸附miRNA起作用，進而限制miRNA分子與信使RNA 3'-非翻譯區結合的能力。目前，已有研究證明LncRNA在胃腸道腫瘤、惡性黑色素瘤、鼻咽癌、骨腫瘤等多種惡性腫瘤中發揮重要的生物學調控過程[14]。LncRNA ADAMTS9-AS1位于人類染色體3p14.1，在腫瘤發生過程中發揮抑癌基因的功能，在腫瘤細胞生長和增殖過程中起抑制作用。多項研究結果表明，LncRNA ADAMTS9-AS1在前列腺癌、結直腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤組織中表達顯著下調，導致Wnt/β-catenin信號通路活化，促進腫瘤惡性增殖，并且是潛在的腫瘤診斷生物標志物[5,15-16]。本研究結果發現，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1表達顯著下調，且LncRNA ADAMTS9-AS1的表達與腫瘤分期和淋巴結轉移有相關性。表明LncRNA ADAMTS9-AS1能夠作為抑癌因子，抑制乳腺癌的發生發展。其機制可能是LncRNA ADAMTS9-AS1能夠結合下游分子，促進下游抑癌基因的表達，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移[9]。而體外細胞實驗中亦證實，異位過度表達LncRNA ADAMTS9-AS1不僅能夠抑制腫瘤細胞生長和集落形成，還能降低乳腺癌細胞的侵襲能力。因此，LncRNA ADAMTS9-AS1可能是抑制乳腺癌惡性進展的重要分子。進一步分析乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1表達的臨床意義，本研究結果發現LncRNA ADAMTS9-AS1的低表達與乳腺癌患者的不良預后有關，也是患者不良預后的獨立危險因素。因此檢測癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1的表達水平可能有助于判斷乳腺癌患者的臨床預后，指導其臨床診治。

miRNA是長度19～25 nt的RNA分子，成熟的miRNA通過結合Dicer核糖核酸內切酶，構成RNA誘導的沉默復合物，參與靶基因的表達調控，廣泛影響多種生物學過程[17]。miR-513a-5p編碼基因位于人類X染色體上。有研究結果表明，miR-513a-5p在結直腸癌、腎細胞癌等惡性腫瘤中表達異常升高，能通過抑制抑癌基因的表達，促進腫瘤的惡性進展[18-19]。本研究結果發現，乳腺癌組織中miR-513a-5p的表達顯著上調，分析其原因，可能與腫瘤微環境中細胞因子如胰島素生長因子1的表達增加有關。Chen等[20]研究發現，腫瘤中胰島素生長因子1介導的PI3K信號通路上調了miR-513a-5p的表達。本研究結果還顯示，乳腺癌組織中miR-513a-5p的表達與腫瘤分期和淋巴結轉移有相關性。分析其機制，可能與miR-513a-5p對抑癌基因p53的表達調控有關。Lin等[21]研究報道，miR-513a-5p可以抑制p53表達和同源重組修復(HR)基因活性，miR-513a-5p/p53軸在HR修復的調控過程中發揮了重要的作用，miR-513a-5p可能通過靶向抑制p53的表達，促進腫瘤的惡性進展。此外，miR-513a-5p的表達上調還能夠促進血管內皮生長因子C的表達，促進腫瘤淋巴管的新生，以及腫瘤細胞的淋巴轉移[19]。本研究亦發現，miR-513a-5p的高表達是乳腺癌患者不良預后的獨立危險因素，因此miR-513a-5p的表達水平亦有助于乳腺癌患者臨床預后的判斷。

LncRNA/miRNA軸在癌癥進展過程中的作用已被廣泛證實。在本研究中發現，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1與miR-513a-5p表達呈顯著負相關，生物信息學軟件預測二者之間存在潛在的結合位點，揭示LncRNA ADAMTS9-AS1可能通過與miR-513a-5p相互作用，促進乳腺癌的惡性進展。Fang等[9]在體外細胞實驗中證實，乳腺癌細胞中miR-513a-5p是LncRNA ADAMTS9-AS1的直接作用靶點，LncRNA ADAMTS9-AS1通過負向調控miR-513a-5p的功能促進乳腺癌生長和侵襲性。但仍有一些問題有待進一步探討，一方面是本研究的樣本例數有限，需要較大的病例對照研究證實；此外，進行動物模型體內實驗也能夠進一步闡明LncRNA ADAMTS9-AS1/miR-513a-5p調控軸對乳腺癌生物學行為的影響。

綜上所述，乳腺癌組織中LncRNA ADAMTS9-AS1表達下調，miR-513a-5p表達上調，二者與腫瘤分期和淋巴結轉移有關，是預測乳腺癌患者不良預后的獨立危險因素，有可能成為乳腺癌診治及預后判斷的有效指標。