丙泊酚調控PI3K/AKT信號通路對肺癌細胞增殖、遷移和凋亡的影響

謝圓媛，胡海峰，趙 莉，薛 鵬

近年來，肺癌的發病率逐年上升，已經成為最常見的惡性腫瘤[1]。我國肺癌的發病率及病死率均位居惡性腫瘤之首[2]。雖然針對肺癌的診斷和治療方法不斷改進，但其存活率并無明顯提高，且臨床預后效果差。PI3K/AKT信號通路在腫瘤的發生發展過程中起著重要作用[3]，能夠促進細胞增殖和腫瘤轉移，并抑制細胞凋亡，也與腫瘤的治療及預后密切相關[4]。約90%的非小細胞肺癌細胞株存在PI3K/AKT信號通路的過度激活，以PI3K/AKT信號通路為靶標的新藥研發越來越受到重視[5]。丙泊酚是臨床上常用的麻醉藥物，近年來有研究發現其具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用[6]。本課題將探究丙泊酚能否通過PI3K/AKT信號通路對肺癌細胞的增殖、遷移與凋亡產生影響，并進一步探討其作用機制，為臨床上治療肺癌提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人肺癌A549細胞株(CQH005)購自上海科學院細胞研究所。24只4～6周齡的雄性A/J小鼠(N000018)由延安大學醫學院動物研究中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(陜)2019-003。丙泊酚購自上海源葉生物科技有限公司，RPMI-1640培養基、胎牛血清和Trizol試劑均購自美國Abcam公司，PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒和TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本TaKaRa公司，Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，HE染色試劑盒和RIPA裂解液均購自北京索萊寶科技有限公司，PTEN、PI3K、p-AKT、AKT、mTOR、GAPDH多克隆抗體和山羊抗兔(鼠)IgG二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司，PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養：A549細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，傳代時用0.25%胰蛋白酶進行消化，每2天更換1次培養基，以保證細胞生長所需的營養成分。

1.2.2細胞分組：根據細胞培養基中添加丙泊酚濃度的不同[7]，將細胞分為control組(未添加丙泊酚)、pL組(添加丙泊酚1.5 μg/ml)和pH組(添加丙泊酚2.2 μg/ml)。A549細胞以每孔1×105個接種于24孔板，待細胞融合度達60%時，按照上述分組分別加入不同濃度的丙泊酚，24 h后結束培養，收集各組細胞進行后續實驗。

1.2.3克隆形成實驗：培養24 h后的各組細胞按每孔1×103個接種于60 mm細胞培養皿中。培養14 d后用結晶紫溶液對細胞進行染色，計數含有≥50個細胞的集落，并用顯微鏡拍攝代表性細胞集落并進行統計。

1.2.4細胞劃痕實驗：培養24 h的各組細胞以2×104/ml接種于12孔培養板中，待細胞融合度達90%時，用10 μl無菌槍頭沿培養皿底直線劃痕，形成間隙。應用PBS重復洗滌3次，再加入不含血清的培養基，放入培養箱中繼續培養。24 h后在顯微鏡下觀察細胞愈合程度并拍照，測量細胞間的劃痕距離。

1.2.5流式細胞術：培養24 h后的各組細胞用冷PBS清洗2次，用緩沖液重懸，調整細胞密度為1×105/ml。具體操作按照Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6qRT-PCR檢測：Trizol試劑提取各組細胞的總RNA。使用紫外分光光度計檢測總RNA的純度和含量，并將每個配對的樣品調節至相同濃度。使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒將提取的RNA反轉錄成cDNA；使用TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行qRT-PCR檢測。使用StepOnePlus實時PCR系統完成實驗后，采用2-ΔΔCt法分析數據。實驗相關引物序列見表1。

表1 PTEN、PI3K、AKT、mTOR和GAPDH的引物序列

1.2.7Western blot檢測：RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白，并通過BCA方法進行定量，樣品經變性后進行上樣。按照實驗步驟進行電泳-轉膜-封閉(5%脫脂奶粉)-加一抗孵育[PTEN抗體(1∶1000)、PI3K抗體(1∶1000)、p-AKT抗體(1∶1000)、AKT抗體(1∶1000)、mTOR抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2000)，4℃過夜]-加二抗孵育[山羊抗兔IgG抗體(1∶4000)或山羊抗鼠IgG抗體(1∶4000)，室溫1 h]-顯影曝光。應用Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.2.8小鼠移植成瘤實驗：采用苯并芘誘導小鼠肺癌模型[8]，選取雄性A/J小鼠，經右側胸壁穿刺肺內注射50 μl苯并芘-玉米油溶液(苯并芘濃度為20 mg/ml)，每周1次，共注射4次。4周后，HE染色驗證造模是否成功。造模成功的24只小鼠被隨機分為c組、p1組(腹腔注射丙泊酚20 mg/kg)和p2組(腹腔注射丙泊酚50 mg/kg)[9]，每組8只。c組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，p1組和p2組腹腔注射相應劑量的丙泊酚，每天給藥1次、連續給藥28周。末次給藥2 h后處死小鼠，取全肺組織，體視顯微鏡測量各組肺部腫瘤的數量及大小并拍照。

2 結果

2.1丙泊酚對A549細胞增殖的影響 克隆形成實驗結果顯示，與control組比較，pL組和pH組均能抑制A549細胞增殖能力，差異有統計學意義(P<0.05)；且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 丙泊酚對A549細胞增殖的影響(結晶紫染色×40)

2.2丙泊酚對A549細胞遷移的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，與control組比較，pL組和pH組均能抑制A549細胞遷移能力，差異有統計學意義(P<0.01)；且呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 丙泊酚對A549細胞遷移的影響

2.3丙泊酚對A549細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果表明，與control組比較，pL組和pH組能促進A549細胞的凋亡，差異有統計學意義(P<0.01)；且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 丙泊酚對A549細胞凋亡的影響

2.4丙泊酚對A549細胞PTEN、PI3K、AKT及mTOR mRNA和蛋白表達的影響 qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，與control組比較，pL組和pH組能夠抑制A549細胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA和蛋白的表達以及AKT的磷酸化程度，提高PTEN mRNA和蛋白的表達，差異有統計學意義(P<0.01)；且呈劑量依賴性。見圖4。

圖4 丙泊酚對A549細胞PTEN、PI3K、AKT及mTOR mRNA和蛋白的表達情況

2.5丙泊酚對小鼠肺部腫瘤生長的影響 用苯并芘誘導A/J小鼠復制肺癌模型，HE染色確定模型制備成功，并給予丙泊酚腹腔注射處理、連續給藥28周，通過對小鼠肺部腫瘤數量及大小測量發現，與c組比較，p1組和p2組腫瘤數量顯著減少、腫瘤體積顯著減小，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見圖5。

圖5 丙泊酚對A/J小鼠肺部腫瘤生長的影響

3 討論

肺癌是一種臨床常見的惡性腫瘤，發病率和病死率較高。男性肺癌患者的發病率和病死率在各種惡性腫瘤中居首位，且臨床預后效果差[10]。據相關數據顯示，每年新增肺癌患者約182.5萬，因肺癌而死亡的患者約159萬[11]。臨床上80%～85%的肺癌患者為非小細胞肺癌，而且有80%的患者在確診時就已經屬于中晚期，只能進行化放療、靶向治療或者中醫藥治療[12-14]。因此，尋找新的肺癌治療藥物至關重要。

PI3K/AKT信號通路與腫瘤細胞的生長和轉移有著高度的相關性，腫瘤細胞會使該通路異常激活，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移[15]。AKT在PI3K/AKT信號通路中占重要地位，其可以通過磷酸化作用直接或間接影響下游靶蛋白[16-17]。而且PI3K/AKT信號通路在多種腫瘤組織中呈現高表達，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌等[18]。

丙泊酚作為臨床上應用最為廣泛的全身麻醉藥物，可通過激活內質網應激介導多種癌細胞的凋亡[19]。相關研究表明，丙泊酚還具有抗炎、抗氧化等作用[20]，而且大量研究證實丙泊酚還具有抑制腫瘤細胞轉移的作用，但其具體機制尚不完全清楚[21-22]。本實驗探討了丙泊酚對肺癌細胞增殖、遷移和凋亡的影響，結果表明，與control組比較，pL組和pH組均能抑制A549細胞的增殖能力和遷移能力，且能促進A549細胞的凋亡；以上實驗數據表明丙泊酚能夠抑制肺癌細胞的增殖、遷移，促進肺癌細胞的凋亡。

本實驗進一步探討了PI3K/AKT信號通路在肺癌中的作用，以及丙泊酚對PI3K/AKT信號通路的影響，結果顯示，與control組比較，pL組和pH組均能抑制A549細胞中PI3K、AKT和mTOR mRNA和蛋白的表達，提高PTEN mRNA和蛋白的表達。以上實驗結果表明丙泊酚能夠抑制PI3K/AKT信號通路的激活。最后，本研究進行了小鼠移植成瘤實驗，結果發現，丙泊酚抑制了腫瘤的生長，小鼠肺部腫瘤的數量顯著減少、腫瘤體積也顯著減小，說明丙泊酚能夠抑制小鼠肺部腫瘤的生長。因此，丙泊酚可能通過抑制PI3K/AKT信號通路來抑制肺癌細胞的增殖、遷移，并促進肺癌細胞的凋亡。

綜上所述，丙泊酚能夠抑制肺癌細胞的增殖、遷移，促進其凋亡，還能抑制小鼠肺部腫瘤的生長，其機制可能是通過增加PTEN的表達，抑制PI3K/AKT信號通路激活實現的。但丙泊酚的作用機制是否還有其他途徑尚需要進一步研究證實。