冷凍儲藏下三唑類殺菌劑在香蕉中的殘留穩定性研究

陳麗霞 陳歆 許麗建 彭黎旭

(1 瓊臺師范學院理學院 海南海口 571100;2 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所 海南海口 571101)

三唑類殺菌劑近年來被廣泛用于防治香蕉葉斑病、黑心病［1-3］，但是由于三唑類殺菌劑具有藥效持續時間長、內吸輸導性強等特點，在香蕉中通常具有較長的降解半衰期，容易在香蕉果實中帶來殘留風險，是香蕉樣品中的最常見檢出農藥之一［4-6］。在香蕉樣品的檢測過程中，樣品在采集制備后，通常不能立即檢測，需要冷凍儲藏一段時間后進行分析。在此過程中，殘留的農藥由于揮發或者發生一些水解、光解及酶促反應等可能會發生降解，有可能發生降解代謝，引起濃度變化，影響測定結果。因此，想要準確評估農藥安全性，研究冷凍儲藏下農藥殘留穩定性具有重要的意義［7-9］。有研究報道多種農藥的儲藏溫度、樣本基質及基質狀態對農藥殘留的穩定性均有影響，但不同的農藥影響大小各不相同，其中溫度對農藥的影響較為一致，冷凍條件下的農藥殘留最穩定［10-12］。

在我國GB 2763—2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中，明確規定香蕉的測定部位為全蕉，但是由于香蕉果肉和果皮的成分并不相同，農藥在冷凍儲藏過程中穩定性可能存在差異［13-14］，對香蕉中農藥殘留存在一定影響，但是目前尚未見相關研究報道。本研究選擇丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑三種三唑類殺菌劑，研究其在香蕉全果、果肉和果皮中的穩定性，為香蕉中三唑類殺菌劑的殘留檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

香蕉樣品采自海南省澄邁縣永發鎮香蕉種植基地。

1.1.2 儀器

實驗儀器包括AB SCIEX API4000＋質譜系統（AB SCIEX 公司），超高壓液相色譜系統（Waters公司），UPLC?BEH C18 色譜柱 （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）（沃特世科技（上海）有限公司）、高速離心機（IKA 公司）、多管渦旋混合機（北京同德創業科技有限公司）、高速勻漿機（IKA 公司）、微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）、電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、精密移液槍、0.22 μm 有機微孔濾膜（大龍興創實驗儀器（北京）有限公司）。

1.1.3 試劑

實驗用水均為超純水（Millipore，USA），乙腈、甲醇（色譜純，Fisher 試劑公司），氯化鈉（分析純，廣州化學試劑廠），PSA 吸附劑（N-丙基乙二胺，分析純，Biocomma 公司）。含丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑的農藥制劑，分別購自海口市農資店。丙環唑、戊唑醇標準品購自農業部環境質量監督檢驗測試中心（天津），苯醚甲環唑標準品購自德國Dr Eh-renstorfer GmbH公司。

1.2 方法

1.2.1 冷凍樣品的制備

香蕉樣品采集后，將果肉和果皮分離，同時取香蕉全果，將香蕉全果、果肉和果皮切塊得到全果、果肉和果皮樣品。分別稱取500 g 香蕉全果、果肉和果皮樣品。準確稱取10.0 g 香蕉全果、果肉和果皮塊狀樣品，裝入50 mL 離心管，分別添加0.1 和3.0 mg/kg 的丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑的農藥制劑水溶液，作為冷凍香蕉樣品。在-20℃冷凍儲藏，在預定時間取出，制備成為勻漿樣品并進行分析。

1.2.2 樣品前處理

在香蕉全果、果肉和果皮的空白樣品中分別加入丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑3 種殺菌劑，并記為0 d。在香蕉冷凍儲藏后第15、30、60、90天，取樣品進行分析，加入20 mL 乙腈，并高速勻漿2 min，加入氯化鈉2 g，蝸旋劇烈震蕩1 min后，以4 000 r/min 的轉速離心5 min。取5 mL 上清液于PSA凈化劑中，蝸旋劇烈震蕩1 min，以4 000 r/min的轉速離心 5 min，取上清液 2.0 mL 經 0.22 μm 微孔濾膜過濾，裝入進樣小瓶，使用UPLC-MS/MS 進行測定。

1.2.3 儀器分析條件

色 譜 條 件 ： ACQUITY UPLC?BEH C18 色 譜 柱（50 mm×2.1 mm×1.7μm）；柱溫：35℃；進樣量：10 μL；流速：0.25 mL/min；所用流動相為0.1%甲酸-水（A）和乙腈（B）。梯度設置為：0～2 min：保持 95%A；2～4 min：A 從 95% 到 5%；4～5 min：保持5%A；5～7 min：A從5%到95%。

質譜條件：電噴霧正離子（ESI+）掃描，噴霧電壓：5 000 V；毛細管溫度：600℃；多反應監測（MRM）模式。定性和定量的離子、去簇電位（DP）和碰撞電壓（CE）如表1所示。

表1 質譜工作條件

2 結果與分析

2.1 分析方法準確性及定量限

經預實驗驗證，香蕉樣品存在一定的基質效應。為了保障數據的準確性，本實驗均采用基質標準曲線。以濃度10 μg/mL 的丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑3種殺菌劑混合標準溶液作為母液，分別用全果、果肉和果皮空白樣品提取液逐級稀釋法配置0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.5 μg/mL的系列標準工作溶液，外標法進行定量。以丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑三種殺菌劑基質標準溶液濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。表2 列出了3 種殺菌劑在甲醇溶液中線性方程及相關系數，其中丙環唑和苯醚甲環唑靈敏度較差，0.005 μg/mL 信號穩定性較差，因此其線性范圍為0.01～0.5 μg/mL，戊唑醇的線性范圍為0.005～0.5 μg/mL。考慮到液質在測定目標物存在基質效應，樣品測定時均采用空白樣品提取液配制基質標準，其線性關系均優于0.999。方法測定丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑3種殺菌劑的定量限分別為0.01、0.005和0.01 mg/kg。

表2 三種殺菌劑的標準曲線及相關系數

本研究分別選擇定量限0.01 mg/kg 和最大的殘留限量3.0 mg/kg，并設置中間濃度0.10 mg/kg進行添加回收率實驗，分別在香蕉全果、果肉和果皮樣品中添加0.01、0.10 和3.0 mg/kg 三個不同濃度的3種殺菌劑，并通過回收率判定分析方法的準確性。表3 列出了在0 d 時測定三種殺菌劑的添加回收率與相對標準偏差。我國標準“農作物中農藥殘留試驗準則（NY/T 788—2018）”中規定，添加水平在0.01、0.10 和3.0 mg/kg 時，回收率應分別在60%～120%、70%～120%和70%～110%，相對標準偏差分別在30%、20%和10%以內。本實驗在測試的3個濃度水平，丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑3種殺菌劑的添加回收率和相對標準偏差均滿足要求。

表3 三種殺菌劑在香蕉不同基質中中的添加回收率及相對標準偏差（n=5）

2.2 香蕉不同基質中3種殺菌劑的穩定性

香蕉全果、果肉和果皮中，0.1 mg/kg 三種殺菌劑在冷凍儲藏下的穩定性實驗結果見圖1。丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑3種殺菌劑在香蕉不同基質中120 d 內均保持很好的穩定性。在120 d 后，3種殺菌劑的穩定性各不相同，其中丙環唑在360 d時，在香蕉全果、果肉和果皮中均能保持很好的儲藏穩定性。戊唑醇和苯醚甲環唑在果皮中儲藏360 d 也能保持很好的穩定性，但是在全果和果肉中儲藏180 和360 d 后，均存在一定的降解，其中果肉中殘留量最低，分別降低至83%和76%。說明3 種殺菌劑在香蕉果皮中最容易保持穩定，其次為香蕉全果，在香蕉果肉中更容易降解。

2.3 不同濃度的3種殺菌劑在香蕉中的穩定性

實驗分別測試了0.1 和3.0 mg/kg 兩種不同濃度的丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑3種殺菌劑在香蕉不同基質中的穩定性，結果見圖2。從圖2 可以看出，3 種殺菌劑在3.0 mg/kg 儲藏濃度時，丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑3 種殺菌劑在儲藏360 d以后，其在全果、果肉和果皮3種樣品基質中的濃度均能穩定在90%以上。在0.1 mg/kg儲藏濃度時，丙環唑在全果、果肉和果皮3種樣品基質中的濃度也能穩定在90%以上；戊唑醇和苯醚甲環唑在香蕉果皮中濃度穩定在95%以上，但是戊唑醇和苯醚甲環唑在全果和果肉中儲藏360 d 后，其濃度出現下降。說明丙環唑在實驗的低濃度和高濃度時均能保持較好的穩定性，戊唑醇和苯醚甲環唑在實驗的高濃度時也保持較好的穩定性，但是在低濃度時長時間儲藏可能會降解。

3 討論與結論

3.1 農藥溶解度的影響

農藥在農產品儲藏中的降解受環境的溫度、濕度，農藥本身的物理化學性質，樣品基質性質包括樣品基質的含水量、基質的pH 值以及其所含的微生物、有機質成分等影響［15］。有研究報道，農藥的穩定性與其水溶性相關［16］，本實驗結果表明，丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑在高濃度時均能穩定儲藏360 d 以上，但是在低濃度時，戊唑醇和苯醚甲環唑均存在一定的降解，其可能與3種殺菌劑的溶解度相關。

圖1 0.1 mg/kg三種殺菌劑在香蕉不同基質中的穩定性結果

3.2 樣品含水量的影響

樣品的含水量是影響農藥穩定性的另一重要因素［17］，實驗測試了香蕉全果、果肉和果皮3 種基質的含水量，分別為70%～80%、60%～70%和85%～90%。結果表明，3 種殺菌劑的降解速率與含水量差異無顯著相關性。有文獻報道生物代謝是影響苯醚甲環唑在芒果中降解的主要因素［18］，香蕉營養成分豐富，為生物代謝降解農藥提供了物質基礎。香蕉果肉中的營養物質明顯高于香蕉果皮［19-20］，可能導致丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑3種殺菌劑在果皮中穩定性最好，在果肉中降解中速度較快。

圖2 不同濃度的3種殺菌劑在香蕉不同基質中的穩定性結果

3.3 樣品中農藥殘留濃度的影響

我國農業行業標準明確規定農藥殘留儲藏穩定性實驗的添加水平至少應達到各組分定量限的10 倍［21］，同時，我國食品安全國家標準中規定丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑在香蕉中的最大殘留限量分別為1、3和1 mg/kg［22］。因此，本實驗設置了0.1 mg/kg 的低濃度，同時設置高濃度3 mg/kg。結果表明，3 種殺菌劑在低濃度和高濃度時冷凍儲藏均能保持較好的穩定性，丙環唑在2種濃度是穩定性差異不顯著，但是戊唑醇和苯醚甲環唑在低濃度儲藏120 d 后下降速度加快，與高濃度差異顯著。這說明低濃度時殘留濃度容易受降解速率的影響，建議在樣品分析時應盡快測定，避免濃度過低出現較大的變化。

本研究結果表明，丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑3種殺菌劑在香蕉全果、果肉和果皮中有較好的冷凍儲藏穩定性。在儲藏360 d 以后，在全果、果肉和果皮3 種樣品基質中的濃度均能穩定在90%以上。而在3 種不同的香蕉基質之間，3 殺菌劑在香蕉果皮中最容易保持穩定，其次為香蕉全果，在香蕉果肉中更容易降解。