雷公藤治療類風濕性關節炎的分子機制研究

周文旭，佘君，梁熹，張玉磊，趙穎丹

（西安交通大學醫院內科，陜西 西安 710049）

0 引言

類風濕性關節炎（RA）是一類全身性疾病，以滑膜炎癥和關節的進行性破壞為特征[1,2]。盡可能延遲和緩解RA對骨關節功能造成的損害是治療類風濕關節炎治療的目的[3]。在RA活動期，滑膜組織及血管翳組織過度增生并侵蝕關節軟骨，從而直接破壞關節周圍的骨組織，因此誘導滑膜組織的細胞凋亡及抑制炎性滑膜組織增生成為RA治療的研究熱點[4,5]。

雷公藤具有調節免疫、抗炎止痛等作用，治療RA效果確切，但目前尚不明確具體的作用機制。本文擬建立佐劑性關節炎大鼠模型(adjuvant arthritis，AA)，研究雷公藤對滑膜組織Bax、caspase-3、caspase-9及Bcl-2蛋白表達的影響，探討雷公藤治療RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡清潔級Wistar大鼠，購于中國醫學科學院生物制品研究所。

1.2 藥品與試劑

弗氏不完全佐劑與酸可溶性II型膠原蛋白（CII)購自Sigma公司，雷公藤片為華潤三九（黃石）藥業有限公司產品。辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠IgG、Bcl-2、Bax、Caspase-9、 Caspase-3和GAPDH抗體及為碧云天生物技術有限公司產品。熒光定量試劑為北京康為世紀生物科技有限公司產品，反轉錄試劑盒為美國Thermo公司產品；Trizol購自invitriogen公司提供；引物由invitriogen公司合成。

1.3 方法

1.3.1 動物造模與分組

選取體重50g-100g的清潔級Wistar大鼠40只，用0.lmmol/L醋酸溶解II型膠原蛋白，濃度為2mg/mL，然后4℃過夜，再混合等量的弗氏完全佐劑，充分乳化在冰浴中。實驗組每只大鼠尾根部皮下多點注射膠原蛋白0.2mg。造模后l0日，大鼠隨機分為5組，分別為高、中、低給藥組、模型組、假模型組，每組各8只。每組給藥量如下：高給藥組：50mg/kg，中給藥組：10 mg/kg，低給藥組：1mg/kg，按10mL/kg劑量每日1次灌胃，模型組、假模型組給予每日1次的1.0g/kg等量生理鹽水灌胃。各組給藥頻次按照臨床用藥規格給藥，用藥30d。用毛細管放大測量法在致炎后第14, 16, 18, 20, 24, 28日測右后足體積，求腫脹增長百分率[(給藥后值-給藥前值)/給藥前值]×100%。在造模前、造模后每周測 1次體重，每天觀察大鼠的神志及活動狀態、體毛的色澤改變、全身遲發性變態反應、局部炎癥紅腫等。

1.3.2 分離培養滑膜細胞

大鼠末次給藥后24h，無菌操作取大鼠膝關節滑膜組織，剪成1 mm3大小后加4 m10.4mg/mL的II型膠原酶溶于DMEM培養基(含10%胎牛血清)，孵育3h（5% CO2條件下），離心收集未貼壁的細胞，將細胞重懸于DMEM培養基(含100U/mL青霉素、15%胎牛血清、100μg/mL鏈霉素），在5%CO2體積分數，37℃的培養箱中培養。第2～4代細胞用于實驗。用DMEM培養液（含15%小牛血清）將滑膜細胞數調整至每毫升1×106個細胞，每孔2mL，加入6孔培養板內，在5%CO2體積分數，37℃的培養箱中培養4h。

1.3.3 凋亡蛋白mRNA表達水平測定

按試劑盒說明書進行滑膜細胞總RNA抽提。按試劑盒一步法步驟，采用半定量RT-PCR法進行，引物序列具體見表1。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Doe Gel 1000成像系統觀察結果并拍照并進行吸收度積分值分析，目的基因mRNA的相對含量為目的基因 PCR產物吸收度積分值比內參照GAPDH PCR產物的吸收度積分值，重復3次實驗。

表1 線粒體凋亡途徑凋亡蛋白qRT-PCR引物序列及相應產物大小

1.3.4 凋亡蛋白表達測定

提取細胞總蛋白后取50μg蛋白質樣品，加上樣緩沖液煮沸變性，進行10%SDS PAGE；電轉移至PVDF膜；用TBS(含5%脫脂奶粉，pH 8.0)封閉2h；分別加入適量Caspase-3兔多抗IgG(1:400)、Bax鼠單抗IgG (1:400)、Bc1-2、室溫下在搖床上反應2h；每次20min洗膜，3次后加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1:6000)，室溫反應2h；洗膜后ECL化學發光及X光顯影。掃描儀掃描圖像后，用 Band Scan 5.0進行吸收度積分值分析，目的蛋白表達量的相對含量為目的蛋白與內參照GAPDH蛋白表達量的吸收度積分值之比，重復3次實驗。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 佐劑關節炎大鼠模型的制備

和正常組相比，致炎組大鼠精神萎靡，毛色晦暗并輕微脫毛，體重增長緩慢，食量減少，雙側后踝關節出現明顯腫脹，尾部出現明顯結節，說明造模成功，模型成功率達90.6%。模型組在致炎14d后大鼠右后足開始腫脹，腫脹度達峰值在致炎后28d左右。相比模型組，雷公藤抑制大鼠足腫脹有劑量依賴性，且模型組的足越腫脹，其抑制作用越強，在致炎后18d前后雷公藤抑制作用達峰值，見圖1。其中，我們選擇中劑量給藥組進行下面的實驗。

圖1 雷公藤抑制佐劑關節炎大鼠大鼠足腫脹的作用

2.2 對大鼠關節滑膜組織中凋亡蛋白mRNA表達的影響

RT-PCR結果(圖2)顯示，與模型組相比較，中劑量給藥組Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA表達均上調（P＜0.01）,而Bcl-2 mRNA表達則明顯下調(P＜0.01)。

圖2 線粒體Caspase-3、Caspase-9、Bax、 Bcl-2mRNA表達水平

2.3 對大鼠關節滑膜組織中凋亡蛋白表達的影響

結果表明(圖3)，與模型組相比，中劑量給藥組的Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達明顯上調；Bc1-2蛋白表達量下降 (P＜0.01)。

圖3 線粒體Caspase-3、Caspase-9、Bax、 Bcl-2表達水平

3 討論

抗類風濕性關節炎的藥物試驗中，廣泛應用II型膠原誘導的大鼠關節炎(CIA)動物模型。在本試驗中，與模型組相比，雷公藤顯示劑量依賴性抑制CIA大鼠足腫脹，(P＜0.01)，說明其對CIA大鼠的足腫脹有顯著抑制作用。

造成關節損害的主要病理基礎是RA滑膜過度增生、增厚。1972年Kerr提出細胞凋亡的概念后，細胞凋亡研究領域己成為自身免疫疾病的熱點之一。細胞增殖和細胞凋亡在RA的發生發展過程中細胞凋亡數是相對減少，即滑膜組織中細胞增殖數和細胞凋亡數均呈增加趨勢，但前者增加遠遠高于后者，從而導致滑膜細胞增生過度[6,7]。說明RA發病不僅僅是由于其滑膜細胞增生調控一方面的事情，其滑膜細胞的過度增生與其凋亡機制障礙密切相關。凋亡是多基因嚴格控制的過程。這些基因有Bcl-2家族、caspase家族、C-myc、P53等。

我國用中草藥治療風濕病的歷史己有上千年，通過誘導RA滑膜細胞凋亡，許多藥物如甲氨喋吟、青風藤等均可抑制關節免疫炎癥[8]。雷公藤臨床應用于治療風濕性疾病歷史悠久，取得了很好的療效，但其藥理機制尚不明確，對其抗風濕的藥理機制研究特別是其對類風濕關節炎凋亡方面作用的研究還存在著許多空白，因此，研究其對類風濕關節炎凋亡的影響是一項新的方向。

在本研究中發現雷公藤能明顯減輕CIA大鼠足腫脹度，改善大鼠的關節炎癥狀。進一步研究發現，模型組大鼠滑膜細胞的Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達下降，而Bcl-2表達增加，顯示細胞增生與細胞凋亡不平衡，滑膜細胞凋亡相關基因表達異常從而導致滑膜細胞增生。本研究中雷公藤使大鼠滑膜細胞Bax、Caspase-9、Caspase-3表達明顯升高，Bc1-2表達減少，說明雷公藤通過調控凋亡相關基因，誘導caspase-9、caspase-3活化，促進滑膜細胞的凋亡，抑制滑膜細胞的增殖，發揮其治療RA關節炎的作用。