胱天蛋白酶募集域蛋白9基因多態(tài)性與急性胰腺炎易感性的相關(guān)性研究

王靜 任大賓 楊志文

1上海市松江區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 201600；2上海市松江區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，上海 201600

研究表明，基因多態(tài)性可能是AP患者重要的影響因素之一，可以增加AP的發(fā)病風(fēng)險。其中Toll樣受體、腫瘤壞死因子α、IL-8、IL-1β、IL-6等炎癥因子基因多態(tài)性是AP 嚴(yán)重程度和炎癥進(jìn)展中重要的易感因素[1-5]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain protein 9，Card 9)是一種表達(dá)于髓系細(xì)胞的接頭蛋白，通常與Bcl 10蛋白相互作用，形成Card 9/Bcl 10復(fù)合體，然后激活NF-κB、MAPK炎癥信號通路，釋放大量炎癥因子[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AP患者外周血Card 9表達(dá)水平可作為評估患者病情嚴(yán)重程度的一個有效的臨床監(jiān)測指標(biāo)[7]，沉默AP大鼠Card 9表達(dá)可抑制NF-κB、p38炎癥信號通路，減輕胰腺的炎癥損傷[8]。因此，本研究探討Card 9基因多態(tài)性與AP患病風(fēng)險的相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年6月至2020年2月間上海市松江區(qū)中心醫(yī)院收治的70例AP 患者的臨床資料。AP診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會胰腺疾病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)[9]，其中MAP 34例，MSAP 27例，SAP 9例。以松江區(qū)中心醫(yī)院體檢健康者70例為對照組。所有受試者均排除慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等干擾指標(biāo)，并簽署知情同意書。

二、研究方法

1．Card 9基因多態(tài)性檢測：抽取研究對象外周血1 ml于EDTA抗凝管，提取全血DNA。采用TaqMan探針法[10]檢測Card 9基因rs10870077、rs4077515、rs10781499、rs141992399、rs139265120多態(tài)性位點(diǎn)。引物及探針序列見表1，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、60℃ 30 s，40個循環(huán)。每次循環(huán)后掃描熒光信號，利用Bio-Rad CFX96熒光定量儀讀取信號，并利用機(jī)器自帶軟件進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分型。

表1 Card 9基因多態(tài)性檢測引物序列

2．血清Card 9 mRNA表達(dá)檢測：抽取研究對象外周血，F(xiàn)icoll密度梯度法分離外周血單核細(xì)胞，提取RNA。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測Card 9 mRNA表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。Card 9正向引物序列為5′-CCCTCACGCATCACACCTTACC-3′，反向引物序列為5′-GTCCAGGAGCACACCCACTTTC-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物序列為5′-AATCCCATCACCATCTTC-3′，反向引物序列為5′-AGGCTGTTGTCATACTTC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)條件為95℃10 min，95℃15 s、60℃ 45 s，40個循環(huán)。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，以公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量。

3．血清IL-6和降鈣素原水平檢測：抽取研究對象外周血，4 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，分離血清。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清IL-6、降鈣素原水平。

4．血清CRP水平檢測：抽取研究對象外周血，4 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，分離血清。采用散色比濁法檢測CRP水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、臨床資料

27例MSAP患者中膽源性19例、高脂血癥5例、特發(fā)性3例，無器官功能衰竭和死亡。9例SAP患者中膽源性4例、高脂血癥3例、酒精性1例、特發(fā)性1例，2例發(fā)生器官功能衰竭，1例死亡。MSAP組、SAP組患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血淀粉酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、CRP水平均顯著高于MAP組和對照組(表2)。

表2 70例急性胰腺炎患者的臨床資料

二、Card 9基因多態(tài)性性位點(diǎn)與AP患病風(fēng)險的相關(guān)性

AP患者Card 9 rs10870077 C﹥G突變率(CG基因型占比)顯著高于對照組(50.0%比31.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Card 9 rs10870077 CG基因型是AP的易感因素(表3)。AP患者Card 9 rs4077515AG、rs10781499AG基因型占比與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)，而rs141992399 C﹥G、rs139265120 A﹥G突變率太低，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表5)，表明這4個Card 9基因位點(diǎn)突變不是AP的易感因素。

表3 急性胰腺炎組與對照組Card 9 rs10870077位點(diǎn)基因類型和等位基因的分布[例(%)]

表4 急性胰腺炎組與對照組Card 9 rs4077515、rs10781499位點(diǎn)基因型和等位基因的分布[例(%)]

表5 急性胰腺炎組與對照組Card 9 rs141992399、rs139265120位點(diǎn)基因型和等位基因的分布[例(%)]

三、Card 9 rs10870077 CG基因型與AP病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

MAP組、MSAP組、SAP組患者Card 9 rs10870077 CG基因型與對照組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，提示Card 9 rs10870077 CG基因型與AP病情嚴(yán)重程度無相關(guān)性(表6)。

表6 3組急性胰腺炎患者及對照組Card 9基因rs10870077 C﹥G突變的分布[例(%)]

四、Card 9 rs10870077 CG基因型對AP患者血清Card 9 mRNA表達(dá)的影響

Card 9 rs10870077 CG、rs4077515AG、rs10781499AG基因型AP患者和對照組血清Card 9 mRNA表達(dá)量分別為6.20±2.82、5.00±2.22、5.01±2.24、3.90±1.96，rs10870077 CG基因型AP患者明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而rs4077515AG、rs10781499AG基因型AP患者血清與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Card 9 rs10870077 C﹥G突變可上調(diào)AP患者血清Card 9 mRNA表達(dá)。

五、Card 9 rs10870077 CG基因型對AP患者血清IL-6水平的影響

Card 9 rs10870077 CC、GG、CG基因型AP患者的血清IL-6水平分別為(372.5±1127.9)、(385.5±598.7)、(614.7±1531.8)ng/L，CG基因型較CC、GG基因型顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而CC基因型與GG基因型IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示Card 9 rs10870077 C﹥G突變促進(jìn)IL-6的合成及分泌，加重AP炎癥反應(yīng)。

六、Card 9 rs10870077 CG基因型對AP患者血清CRP、降鈣素原水平的的影響

Card 9 rs10870077 CC、GG、CG基因型AP患者的血清CRP水平分別為(46.10±52.55)、(55.30±87.02)、(34.84±50.64 )mg/L，降鈣素原水平分別為(2.86±10.20)、(0.77±1.12)、(1.98±4.70)μg/L，CG基因型CRP水平顯著低于GG基因型，降鈣素原水平顯著高于GG基因型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而CG基因型與CC基因型CRP、降鈣素原水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示Card 9 rs10870077 C﹥G突變與AP患者的細(xì)菌感染無相關(guān)性。

討 論

Card 9是髓系細(xì)胞的一種重要免疫炎性蛋白，參與NF-κB、MAPK信號通路的活化，釋放大量的炎癥因子。文獻(xiàn)報道，Card 9 rs372539632、rs1433023025、rs775284320、rs1278536786、rs372360475、rs137986801、rs1379376784、rs151075995、rs1342330215、rs773595074等23個位點(diǎn)基因突變與人類某些疾病相關(guān)，如真菌感染、IgA腎病、肺結(jié)核、原發(fā)性免疫性血小板減少、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎[11]。目前較多的研究聚焦于Card 9基因多態(tài)性與炎性腸病的關(guān)系[12-15]，例如Card 9基因N端3個單核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)(rs10870077、rs4077515、rs10781499)能夠與含有Card結(jié)構(gòu)域的Bc110蛋白結(jié)合，促進(jìn)Card 9/Bc110復(fù)合物形成，上調(diào)炎癥因子分泌，加重炎性腸病[12-14]；Card 9基因C端2個單核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)(rs141992399、rs139265120)抑制泛素蛋白鏈接酶(TRIM62)招募，阻斷Card 9/Bc110復(fù)合物的形成，下調(diào)炎癥因子釋放，減輕炎性腸病[15]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Card 9與AP患者的臨床轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[7-8]。胰腺炎患者外周血單核細(xì)胞Card 9表達(dá)升高，對胰腺炎診斷有較高的靈敏度和特異度，可作為評估AP患者病情嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)[7]。應(yīng)用siRNA沉默Card 9基因可下調(diào)Card 9表達(dá)，從而抑制TRL4介導(dǎo)NF-κB、p38炎癥信號通路的活化，減輕SAP胰腺的炎癥損傷[8]。但Card 9在AP中的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

本研究采用TaqMan探針法檢測Card 9基因rs10870077、rs4077515、rs10781499、rs141992399、rs139265120多態(tài)性位點(diǎn)。結(jié)果顯示，Card 9基因rs10870077位點(diǎn)C﹥G突變是AP發(fā)生的易感因素，但與AP病情嚴(yán)重程度無相關(guān)性，這可能歸因于Card 9 rs10870077 C﹥G突變的SAP患者僅3例，尚需多中心、大規(guī)模前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。本研究結(jié)果還顯示，Card 9 rs10870077 C﹥G突變上調(diào)AP患者Card9mRNA表達(dá)水平，誘導(dǎo)IL-6炎癥因子釋放，促進(jìn)AP炎癥聯(lián)級反應(yīng)，但對感染指標(biāo)CRP、降鈣素原沒有影響，這可能歸因于Card 9主要分布在單核巨噬細(xì)胞，而單核巨噬細(xì)胞活化是AP發(fā)展早期的啟動因子[16]，且AP早期為無菌性炎癥。綜上所述，Card 9基因rs10870077 C﹥G突變可能是AP發(fā)生的易感因素，但與細(xì)菌感染無明確的相關(guān)性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突