人臍帶間充質干細胞對重癥急性胰腺炎患者樹突狀細胞成熟、分化的作用及參與炎癥調節的機制研究

梁馬可 李學民 孫蕾 馬保東 呂朋舉 岳寒

1鄭州大學附屬鄭州中心醫院肝膽胰外科，鄭州 450000；2鄭州大學附屬鄭州中心醫院轉化醫學中心，鄭州 450000；3河南省人民醫院干細胞再生醫學中心 ，鄭州 450000

研究表明，樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)作為機體最重要的抗原提呈細胞，參與胰腺炎的發生和發展[1]。Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是一類跨膜模式識別受體，可通過識別不同的病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)及損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)激活固有免疫細胞，參與炎癥反應。內毒素及炎癥因子可與DCs表面的TLR4識別并結合，促進DCs的成熟并通過經典的TLR4/IKKα/NF-κB/COX-2促炎信號通路引起炎癥級聯放大反應，從而導致全身炎癥反應綜合征[2]。人臍帶間充質干細胞( human umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)屬于干細胞家族的重要成員，不但具有自我更新和多向分化潛能[3]，還具有低免疫原性及免疫調節功能[4-5]，能夠抑制DCs的成熟、分化及誘導調節性樹突狀細胞(regulatory DCs, regDCs)參與免疫調節。但hUC-MSCs對SAP患者DCs的影響尚不清楚。有研究認為hUC-MSCs可以通過分泌抗炎細胞因子、抑制促炎細胞因子及減輕組織損傷來治療SAP[6-7]，但其是否通過抑制TLR4/IKKα/NF-κB/COX-2通路調控炎癥仍需進一步探究。本研究旨在探討體外hUC-MSCs對SAP患者DCs的免疫調節作用及其調控通路，以期為SAP的臨床治療提供新的思路。

材料與方法

一、hUC-MSCs的分離、培養和鑒定

采集鄭州大學附屬鄭州中心醫院行剖宮產的足月胎兒臍帶4～5 cm， PBS充分洗滌，去除血管內殘留血液，無菌條件下分離取出臍帶外膜組織和血管組織，獲得臍帶wharton膠組織，將其盡量剪碎，用0.1% Ⅰ型膠原酶(美國Gibco公司)37℃消化4 h后200目篩網過濾。收集濾液，使用Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3系列離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)以1 700 r/min離心(離心半徑60 cm)8 min，重懸細胞沉淀接種于75 cm2的培養瓶中，添加友康培養基至12 ml，在37℃、5% CO2細胞培養箱中培養，5～6 d第1次換液，以后每2～3 d更換新鮮培養基。當細胞生長至接近85%融合時，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索萊寶公司)消化細胞，1∶3傳代。傳至第3代時收集細胞懸于500 μl PBS中，分別加入FITC-CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR、PE-CD90、APC-CD105、APC-A750-CD73抗體4 μl，4℃避光孵育30 min，離心棄上清，加入1 ml PBS清洗細胞一次，然后將細胞重懸后上流式細胞儀檢測，進行表型鑒定。同時對hUC-MSCs進行成脂和成骨誘導分化，采用油紅O染色液(北京索萊寶公司)進行脂肪細胞染色，采用茜素紅染液(北京索萊寶公司)進行成骨細胞染色。將傳至第3代時的hUC-MSCs提前1 d接種于6孔板中，培養過夜，待hUC-MSCs融合80%～90%時，加入絲裂霉素C(10 μg/ml)，37℃孵育4 h，取出培養基，PBS洗滌2次后備用。

二、DCs分離、培養及分組

采集鄭州大學附屬鄭州中心醫院肝膽胰外科5例SAP患者新鮮肝素抗凝外周靜脈血20 ml，用等量PBS充分混勻后，用滴管沿管壁將外周血緩慢疊加于40 ml淋巴細胞分離液層。2 300 r/min離心(離心半徑60 cm)20 min。吸取白膜層，PBS洗滌細胞2次。洗盡血小板，用RPMI1640完全培養液懸浮細胞, 調整細胞密度為2×109個/L，加入6孔板中，每孔2 ml，放入37℃、5% CO2孵箱中培養4 h后，吸去培養上清，加入預熱的培養液，緩慢搖動培養板去除非貼壁細胞，獲得貼壁的單核細胞。每孔加入2 ml含10 ng/ml GM-CSF、5 ng/ml IL-4和10% FCS的完全培養液培養5 d，隔天半量換液。于第5天開始, 每孔加入100 ng/ml TNF-α，同時以是否與hUC-MSCs共培養及是否加入NF-κB下游調控基因COX-2抑制劑NS398為分組標準，將細胞分為DCs組、hUC-MSCs+DCs組、hUC-MSCs+DCs+NS398組。DCs組為上述培養至第8天收集的懸浮細胞；hUC-MSCs+DCs組為第6天DCs與hUC-MSCs按10∶1的比例共培養于含有100 ng/ml TNF-α、10 ng/ml GM-CSF、5 ng/ml IL-4和和10% FCS的RPMI-1640培養液中，48 h后收集細胞。hUC-MSCs+DCs+NS398組為共培養細胞培養40h后加入75 μmol/ml NS398，繼續培養8 h，收集細胞。

三、DCs表面標志物鑒定

取上述3組1×105個細胞于流式管，每組細胞設5個管，分別加入FITC-Lineage Cocktail 1、PE-anti-human HLA DR、APC-750-anti-human CD11c、APC-anti-human CD80或APC-anti-human CD86，抗體用量按照說明書推薦量，總容積為100 μl。設置同型對照管，加入相同濃度的同型對照抗體。避光保存，并于1 h內上流式細胞儀檢測各組細胞DCs表面標志物CD11b、CD1a、CD11c的表達量。

四、DCs組、hUC-MSCs+DCs組細胞培養上清液細胞因子水平檢測

采集DCs組、hUC-MSCs+DCs組培養24 h上清，使用LEGENDplex自定義11細胞因子檢測板(美國Biolegend公司)，并根據說明書在培養上清中加入磁珠標記的IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-6 、IL-10抗體。避光孵育后采用Cytoflex流式細胞儀進行分析，通過Legendplex V8.0軟件(Biolegend)進行數據分析后根據標準曲線計算得出待測樣本各指標的濃度。

五、各組細胞炎癥相關蛋白NF-κB-p65、IKKα及TLR4表達檢測

取上述3組細胞，采用RIPA裂解液(北京索萊寶公司)抽提細胞總蛋白。BCA法定量蛋白后常規行蛋白質免疫印跡法檢測NF-κB-p65、IKKα及TLR4蛋白表達，以GAPDH作為內參。NF-κB-p65、IKKα、TLR4及GAPDH均購于美國Abcam公司。過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗購于美國Pierce公司。最后ECL發光、X線片曝光、顯影、定影。采用凝膠圖像軟件分析系統掃描圖像，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

六、統計學處理

結 果

一、hUC-MSCs的生物學特性及表型鑒定

第3代hUC-MSCs呈成纖維樣，細胞大小與形態均一、排列有序(圖1A)。hUC-MSCs可成功誘導分化為脂肪細胞(圖1B)、骨細胞(圖1C)。流式細胞儀檢測結果顯示hUC-MSCs表面標志物CD90、CD105、CD73表達陽性，陽性率分別為94.38%、99.45%、94.91%(圖1D～1F)，而CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR表達陰性，符合hUC-MSCs的表型特征。

圖1 hUC-MSCs形態、分化能力及表面標志物鑒定。1A示第3代hUC-MSCs倒置顯微鏡下形態(×100)；1B示hUC-MSCs進行成脂誘導21 d，光鏡下形態(油紅O染色，×100)；1C示hUC-MSCs進行成骨誘導21 d光鏡下形態(茜紅素染色，×100)；1D～1F示流式細胞術檢測hUC-MSCs表面標志物CD90、CD105、CD73表達陽性

二、DCs細胞形態及reg DCs表型鑒定

在DCs培養第3天時，細胞周邊出現較短的樹突狀突起，細胞呈現聚集生長，并隨時間延長聚集更明顯，此時形成未成熟DCs(imDCs，圖2A))。imDC中加入TNF-α培養4～5 d后，成簇的imDCs逐漸分開，細胞體積變大，細胞外突起增多、變長，形成成熟DCs(maDCs，圖2A)。培養至第5天加入hUC-MSCs共培養后，imDCs呈黏附生長，細胞樹突較少(圖2B)，流式細胞檢測CD11b表達增加，CD1a和CD11c表達下降，出現CD11bhighCD1alowCD11clow的表型特點，即為regDCs(圖2B)。

圖2 DCs組培養3～5 d，可見偽足樣凸起，有未成熟DCs及成熟DCs(2A，×10)，加入hUC-MSCs共培養后，DCs多呈黏附生長，細胞樹突較少，主要為regDCs(2B，×10)

三、hUC-MSCs對DCs成熟和分化的影響

與DCs組比較，hUC-MSCs+DCs組的regDCs標志物CD11b表達顯著上調[(14.26±1.25)%比(4.87±0.58)%]，CD1a、CD11c表達顯著下調[(2.81±0.34)%比(13.62±1.52)%、(3.88±0.50)%比(11.80±1.22)% ]，差異均有統計學意義(P值均<0.05，圖3)。提示DCs與hUC-MSCs共培養后，hUC-MSCs抑制DCs的成熟和分化，導致以CD11bhighCD1alowCD11clow為特征的reg DCs比例增加。

圖3 DCs組(1)、hUC-MSCs+DCs組(2)、hUC-MSCs+DCs+NS398組(3)DCs各表型的百分比

四、DCs組、hUC-MSCs+DCs組細胞培養上清液細胞因子水平

與DCs組比較，hUC-MSCs+DCs組培養上清液IL-1β、INF-γ、IL-6水平下降，但差異無統計學意義(P值均>0.05)；而促炎因子IL-1α水平顯著下降，抗炎因子IL-10水平顯著增加，差異均有統計學意義(P值均<0.05，表1)。提示hUC-MSCs可能通過調控DCs增加抗炎細胞因子分泌、抑制促炎細胞因子發揮免疫調節作用。

表1 2組細胞培養上清液IL-1β、INF-γ、IL-6、IL-1α、IL-10水平

五、DCs組、hUC-MSCs+DCs組、hUC-MSCs+DCs+NS398組NF-κB-p65、TLR4及IKKα蛋白表達

與DCs組比較，hUC-MSCs+DCs組NF-κB-p65、TLR4蛋白表達下降，IKKα蛋白表達增加，差異均有統計學意義(P值均<0.05，表2)。與DCs組及hUC-MSCs+DCs組比較，hUC-MSCs-DCs+NS398組的NF-κB-p65、TLR4表達下降，而IKKα蛋白表達增加，差異均有統計學意義(P值均<0.05，表2、圖4)。

表2 3組細胞NF-κB-p65、TLR4、IKKα蛋白表達

圖4 DCs組(1)、hUC-MSCs+DCs組(2)、hUC-MSCs+DCs+NS398組(3)NF-κB-p65、TLR4、IKKα蛋白表達(蛋白質印跡法)

討 論

SAP往往早期出現炎癥級聯反應導致全身炎癥反應綜合征，死亡率高達30%，因此，早期控制炎癥是治療SAP的關鍵。研究認為，SAP引起的炎癥因子、細菌和(或)內毒素等PAMPs或DAMPs可以被宿主DCs表面的TLR4識別并結合，促進DCs的成熟，通過多個信號轉導途徑，引起DCs分泌促炎細胞因子，如TNF-ɑ、IL-8、IL-1β等，從而加重炎性反應[8]。MSCs因其生物學特性，可通過作用于免疫系統包括T細胞、B細胞、DCs、NKs在內的多種免疫細胞來實施免疫調節，調控炎癥反應[9]。有研究表明，與MSCs共培養的DCs即使在促其成熟的脂多糖或TNF-α刺激下仍不表達CD83，且其成熟標志物如MHCⅡ類分子、CD40或CD86表達也未上調[10]，提示MSCs可以抑制DCs的成熟與分化。

有研究報道，在對急性胰腺炎的治療中，MSCs 發揮其免疫調節特性，誘導Foxp3+輔助T細胞的產生，后者誘導中性粒細胞發生凋亡，同時抑制 CD3+以及CD4+T細胞的增殖，進一步降低胰腺炎相關炎性因子，如 TNF-α、γ 干擾素、IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17、誘導型一氧化氮合酶、TGF-β等的表達，同時增加抗炎因子如 IL-4 和IL-10的表達，這些改變又降低了全身炎癥反應的發生率[11]。本研究結果顯示，MSCs誘導的DCs表現出髓系分子CD11c、提呈分子CD1a和共刺激分子CD80、CD86表達明顯下調，而CD11b的表達上調，表明MSCs誘導出了一種不同的DC群體，即regDCs。本研究結果還顯示，hUC-MSC+DCs共培養組分泌的IL-1α、IL-1β、IL-6下降，但IL-10的分泌增加，這也是regDC群體的一個特征。由于體外誘導DCs分化成熟需要IL-4和TNF-α，因此目前無法分析這兩種因子的促炎作用，但本研究結果提示MSCs可以通過調節DCs的分化進而分泌抗炎細胞因子、抑制促炎細胞因子以行使免疫調節作用。

TLRs與炎癥反應的關系目前已明確[12]，其中通過TLR4/IKKα/NF-κB信號通路激活作用于COX-2增加促炎細胞因子合成和釋放，被認為在炎癥發生發展中起著重要作用。而COX-2抑制劑又可以抑制轉錄因子NF-κB或激活蛋白-1(activator protein-1， AP-1)，通過負反饋調節來減弱NF-κB的表達，發揮抗炎和抗增殖作用[13]。但關于SAP時TLR4/IKKα/NF-κB信號通路對DCs成熟及分化影響的研究較少。本研究結果顯示，與hUC-MSCs共培養后，CD11bhighCD1alowCD11clowregDCs比例增加，NF-κB-p65與TLR4蛋白表達顯著下調，IKKα由于組蛋白修飾減少而表達上調；以NS398阻斷NF-κB 下游基因COX-2表達后，NF-κB-p65與TLR4蛋白表達繼續呈現下調趨勢，而IKKα蛋白表達再次顯著上調。提示hUC-MSCs可能通過調節SAP患者DCs的成熟及分化進行免疫調節，進而影響與TLR4的結合，導致IKKα激活減少，使得NF-κB-p65表達下調，最終阻斷NF-κB通路，減少炎癥因子的產生。

綜上所述，hUC-MSCs能抑制DCs的分化及成熟，產生regDCs進行免疫調節，同時經TLR4/IKKα/NF-κB/COX-2途徑抑制炎癥級聯反應，發揮抗炎作用，有效降低全身炎癥反應程度，緩解胰腺及其他臟器的損傷，達到治療SAP的目的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突