透骨消痛膠囊調節Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路抑制骨關節炎炎癥反應的機制研究

林木南，邵 翔，許麗梅，張 欣，朱在師，韓一旦，段辛威，陳建梅，高 松，李西海*

1中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院，福建 福州350025；

2福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州350122

骨關節炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性退行性骨關節疾病，是生物力學、生物學、基因遺傳等多種復雜因素共同作用的結果，其臨床表現為關節疼痛、功能障礙，甚至關節畸形等，主要病理變化為軟骨退變、骨贅形成、軟骨下骨重塑異常等［1-2］。炎癥反應是導致軟骨退變的關鍵因素［3］，而Ras-Raf-絲裂原激活蛋白激酶的激酶（mitogenactivated proteinkinase kinase，MEK）-細胞外信號調節激酶（extracellular-signal-regulated kinase，ERK）信號通路在軟骨基質降解的過程中發揮關鍵的調控作用［4-5］，也是防治OA的潛在有效靶點。微小核糖核酸（micro ribonucleic acids，miRNAs）是一類非編碼的小RNA分子，通過與信使RNA的直接結合，從而起到調控基因表達的作用，參與炎癥反應的調控［6］。其中，miR-27b、miR-34a、miR-146a與OA發生發展密切相關，miR-27b可以靶向基質金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-13，影響軟骨基質的降解［7］，miR-34a則與炎癥因子介導的軟骨細胞凋亡相關［8］，miR-146a可作為炎癥信號通路的負反饋調節器，參與OA炎癥反應中［9］，均已成為OA的生物標志物和治療靶點研究的熱點問題。

透骨消痛膠囊是福建中醫藥大學附屬第二人民醫院院內制劑（批準文號：閩制字Z20100006），具有補肝腎、強筋骨、止痹痛之功，長期應用于臨床，療效可靠。本課題組前期研究顯示，透骨消痛膠囊能夠抑制OA的炎癥反應，但具體作用機制有待深入研究［10］。因此，本研究以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導軟骨細胞炎癥反應為OA細胞模型，采用透骨消痛膠囊干預，觀察Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路中關鍵調控因子表達及miR-27b、miR-34a、miR-146a的變化，旨在揭示透骨消痛膠囊抑制OA炎癥反應的作用機制，為臨床的應用推廣提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

4周齡SPF級SD雄性大鼠20只，購于上海斯萊克實驗動物公司［生產許可證號：SYXK（滬）2017-0005］，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供飼養環境及設施［許可證號：SYXK（閩）2019-0007］。本研究中處理實驗動物方法符合《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 實驗藥物與試劑

透骨消痛膠囊組方：巴戟天12 g，白芍12 g，川芎6 g，腫節風6 g。參照前期透骨消痛膠囊提取方法［11］：14倍量超純水回流提取藥物2次，每次微沸后計時2 h，合并濾液后過濾，旋轉蒸發濃縮，完全干燥后稱取浸膏使用無菌PBS配制藥物母液100 mg／mL，超聲溶解后，無菌濾頭過濾，4℃保存，備用，實驗時根據需要進行稀釋。

LPS（美國Sigma公司）；顯影液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；MMP-3、MMP-13、p-ERK1／2、ERK1／2、MEK1／2、Raf、Ras抗體（美國Abcam公司）；羊抗兔、羊抗小鼠（武漢博士德生物公司）。

2 實驗方法

2.1 軟骨細胞提取與鑒定

采用機械-Ⅱ型膠原酶消化法獲得大鼠原代軟骨細胞，即麻醉處死大鼠后，取雙側膝關節，手術刀片削取透明軟骨層，Ⅱ型膠原酶消化處理，每隔2 h收集消化液，離心后即獲得原代軟骨細胞，進行培養。待細胞長至培養瓶85%時，進行傳代。取第2代軟骨細胞，爬片培養后，多聚甲醛固定、0.5%Txiton處理，根據免疫組化試劑盒（武漢博士德公司）試劑說明進行操作，DAB顯色液（北京中杉公司）顯色，顯微鏡觀察下記錄結果。

2.2 軟骨細胞分組和干預

取對數期生長的第2代軟骨細胞分為4組，參照本課題組前期實驗結果［11-12］，10 ng／mL LPS誘導建立軟骨細胞炎癥模型，透骨消痛膠囊最佳干預濃度為300μg／mL。具體干預方法如下：空白組用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培養基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）培養8 h；模型組用含10 ng／mL LPS的10%FBS DMEM培養8 h；抑制劑組先用含10 ng／mL U0126的10%FBS DMEM干預30 min，再加入LPS培養8 h；透骨消痛膠囊組用含10 ng／mL LPS及300μg／mL透骨消痛膠囊的10%FBS DMEM同時培養8 h。

2.3 蛋白表達檢測

各組干預結束后，收集蛋白樣本，依據碧云天BCA蛋白定量試劑盒說明進行定量，獲取蛋白濃度，變性后，采用蛋白免疫印跡（Western blot）法對蛋白進行處理，顯影曝光后獲得條帶，并選擇β-actin作為內參，進行計算分析。每個指標獲得3次有效數據后，進行統計分析。

2.4 基因表達檢測

各組干預結束后，采用Trizol法提取總RNA，檢測RNA濃度。再依據PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進行逆轉錄，取2μL逆轉錄產物，根據ChamQ?SYBR?qPCR Master Mix說明，上機進行檢測，選擇GAPDH作為參照指標進行計算，其中引物序列見表1。

2.5 miRNAs表達檢測

各組干預結束后，美國Taqman公司mirco-RNA提取試劑盒提取總miRNA，檢測miRNA濃度后，依據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明進行反轉錄，取反轉錄后產物，qPCR法進行檢測，分析計算所得數據。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of qPCR

2.6 統計學方法

3 結 果

3.1 軟骨細胞鑒定結果

Ⅱ型膠原組化陽性組細胞胞漿被染為棕黃色，細胞核呈藍色，陰性對照組細胞胞漿未見明顯棕黃色染色，僅有細胞核被染為藍色，表明所獲得的細胞為軟骨細胞。見圖1。

3.2 軟骨細胞蛋白檢測結果

圖1 免疫組化鑒定（×400）Figure 1 Identification by using immunocytochemistry（×400）

軟骨細胞中Ras、Raf、MEK1／2、MMP-3、MMP-13蛋白表達比較，模型組比空白組明顯升高（P＜0.01，P＜0.05），p-ERK1／2模型組比空白組表達升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，抑制劑組與透骨消痛膠囊組Ras、Raf、p-ERK1／2、MEK1／2、MMP-3、MMP-13蛋白表達均明顯下降（P＜0.01，P＜0.05），其中MEK1／2蛋白表達透骨消痛膠囊組比模型組降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2和表2。

圖2 Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路關鍵調控因子及MMPs蛋白表達比較Figure 2 Comparison of key factors of Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2 signaling pathway and expression of MMPs protein

表2 Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路關鍵調控因子及MMPs蛋白表達比較（±s）Table 2 Comparison of key factors of Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2 signaling pathway and expression of MMPs protein（±s）

表2 Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路關鍵調控因子及MMPs蛋白表達比較（±s）Table 2 Comparison of key factors of Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2 signaling pathway and expression of MMPs protein（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1)P＜0.01,2)P＜0.05.

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3.3 軟骨細胞基因檢測結果

軟骨細胞中MEK1／2、ERK1／2、MMP-3、MMP-13基因表達比較，模型組比空白組均明顯升高（P＜0.01）；抑制劑組、透骨消痛膠囊組比模型組表達均降低（P＜0.01，P＜0.05）。見表3。

表3 MEK1／2、ERK1／2、MMP-3和MMP-13 mRNA表達比較（2-△△CT）（±s）Table 3 Comparison of MEK1／2，ERK1／2，MMP-3 and MMP-13 mRNA expression（2-△△CT）（±s）

表3 MEK1／2、ERK1／2、MMP-3和MMP-13 mRNA表達比較（2-△△CT）（±s）Table 3 Comparison of MEK1／2，ERK1／2，MMP-3 and MMP-13 mRNA expression（2-△△CT）（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1)P＜0.01,2)P＜0.05.

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3.4 軟骨細胞mi RNAs檢測結果

軟骨細胞中miR-27b的表達，模型組低于空白組（P＜0.01），抑制劑組、透骨消痛膠囊組均高于模型組（P＜0.01）；miR-34a、miR-146a的表達，模型組均高于空白組（P＜0.01，P＜0.05），抑制劑組、透骨消痛膠囊組均低于模型組（P＜0.01，P＜0.05）。見表4。

表4 miRNAs表達比較（2-△△CT）（±s）Table 4 Comparison of miRNAs expression（2-△△CT）（±s）

表4 miRNAs表達比較（2-△△CT）（±s）Table 4 Comparison of miRNAs expression（2-△△CT）（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05。Note:Compared with the model group,1)P＜0.01,2)P＜0.05.

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4 討 論

OA屬于中醫學“痹證”“痿證”范疇，病位在肝腎，病在筋骨，以肝腎虧虛、筋骨失養致痿為本，以腠理空虛復感風寒濕邪致痹為標［13］。透骨消痛膠囊由巴戟天、白芍、川芎、腫節風組成，方中巴戟天辛溫，補腎強筋，祛風除濕以治本為君藥；白芍苦酸，養血柔肝止痛為臣藥；川芎辛溫，活血行氣，祛風止痛，腫節風祛風通絡，活血止痛，二者均為佐使藥。四藥共奏補肝腎、強筋骨、止痹痛之功效，長期應用于臨床療效可靠。

Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的一部分［14］。當炎癥因素刺激細胞后，炎癥因子與細胞膜上的受體特異性結合，從而激活MAPK信號下游的Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路，即經信號傳遞后，Ras由失活狀態轉為活化，并進一步活化在胞膜上的Raf，Raf被激活后與信號通路中的“樞紐”MEK結合，從而激活MEK，活化的MEK則與ERK直接聯接，激活ERK，使其由胞漿進入胞核，激活轉錄因子，以此參與調控軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥等生物過程，引起OA軟骨退變等病理改變［15-16］。故Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路是治療OA的一個潛在途徑。LPS則可以通過一系列的級聯反應激活相關炎癥信號通路，刺激多個炎癥因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1等表達，多用于炎癥反應的體外研究。本課題組前期實驗結果亦表明，10 ng／mL LPS干預8 h可明顯刺激TNFα、IL-1β的表達，誘導軟骨細胞炎癥反應［12］。故本研究中選擇LPS作為誘導劑，建立大鼠軟骨細胞體外炎癥模型進行研究。

MMPs是參與細胞外基質變性降解和OA發病的主要蛋白酶。MMPs家族成員眾多，不同的MMPs可作用于不同的軟骨基質導致其降解［17］。MMP-13是引起OA軟骨退變的眾多MMPs中最為關鍵的酶，在軟骨基質的降解中起主導作用，在優先消化Ⅱ型膠原的同時，還能夠降解蛋白多糖，加速破壞軟骨基質。MMP-3在降解多種膠原和蛋白多糖的同時，激活其他的MMPs，介導結締組織的重塑。一般情況下MMPs的正常作用可以維持軟骨基質的合成與降解平衡，而炎癥因子會導致MMPs過度表達，軟骨基質降解過度，最終導致軟骨病變。

本研究結果顯示，經LPS刺激后模型組中Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路的關鍵調控因子及MMP-3、MMP-13表達均明顯增多，表明LPS誘導軟骨細胞炎癥反應模型成功建立。透骨消痛膠囊干預 后 則 明 顯 降 低Ras、Raf、MEK1／2、ERK1／2的 表達，其趨勢同抑制劑組一致，表明透骨消痛膠囊可調控Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路中關鍵因子的表達；同時透骨消痛膠囊干預后MMP-3、MMP-13的表達亦減少，表明透骨消痛膠囊可抑制炎癥反應介導的軟骨基質降解。

在OA中，miRNAs參與調控炎癥因子及MMPs的表達，對軟骨基質的合成、降解有關鍵的調控作用［18］。在使用IL-1β誘導軟骨細胞后，miR-27b的表達明顯降低，并促進Col2a1、抑制MMP-13的表達，從而影響軟骨基質的降解，且MMP-13是miR-27b的靶基因之一［7］。miR-34a則與炎癥因子介導的軟骨細胞凋亡相關，在OA患者軟骨中的表達增多［8］。IL-1β作為誘導劑刺激軟骨細胞后，miR-34a表達明顯增高，并引起細胞死亡和衰老。miR-34a還可以降低Col2a1基因的表達，影響Ⅱ型膠原表達，破壞軟骨的合成［19］。miR-146a則刺激多種炎癥因子的表達，并受炎癥因子的影響。軟骨細胞系ATDC5經LPS刺激后，炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達和產物增加，miR-146a表達亦明顯上升，并且過表達miR-146a后加重了LPS誘導的炎癥損傷［9］。另有研究表明［20］，miR-146a通過靶向TNF受體相關因子6（Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）和IL-1受體相關激酶1（interleukin receptor-1 associated kinase-1，IRAK1）作為促炎信號通路的負反饋調節器，參與到OA炎癥反應中。

本研究結果顯示，與空白組相比，模型組中miR-27b表達明顯降低，miR-146a、miR-34a表達明顯升高，而透骨消痛膠囊干預后，miR-27b表達上升，miR-146a、miR-34a的表達下降，說明透骨消痛膠囊可以調控上述miRNAs的表達，通過調控mRNA的起始調控因子，抑制OA炎癥反應及軟骨基質的降解。

綜上，透骨消痛膠囊通過調控Ras-Raf-MEK1／2-ERK1／2信號通路中關鍵調控因子及miR-27b、miR-146a、miR-34a的表達，調節軟骨細胞炎癥反應，從而抑制骨關節炎炎癥及軟骨基質的降解，保護關節軟骨。但由于OA的發病機制尚未完全明確，且中藥成分復雜具有多靶點的特性，其機制仍需進一步深入研究證實。