阿魏酸鈉對肺結核模型大鼠JNK／P38MAPK信號通路的調節作用及巨噬細胞凋亡的抑制作用研究*

康冠楠，侯莉莉，黨 萍，劉曉飛，耿書軍，馬清艷

（河北省胸科醫院，河北 石家莊 050017）

肺結核多發于老年人，以咳嗽咳痰、發熱、胸悶等癥狀為主要臨床表現，目前臨床主要采用利福平等藥物聯合治療，但這些藥物對肝腎功能的影響較大，且使用療程過長，大大降低了患者的治療依從性［1－2］。阿魏酸鈉是從阿魏、川芎等植物中提取、分離得到的化合物，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗血栓等多種藥理活性［3－4］，對肺部疾病有治療作用，對肺組織有修復作用［5］。目前，尚未見關于阿魏酸鈉對肺結核大鼠藥理作用及作用機制的報道。本研究中建立了肺結核大鼠模型，探討阿魏酸鈉對其c－Jun氨基末端激酶（JNK）／P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信號通路的調節作用，以及對肺泡巨噬細胞凋亡的抑制作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：TS2型倒置顯微鏡（日本尼康公司）；TGL－22S型高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；En-Vision型多功能酶標儀（珀金埃爾默企業管理有限公司）；ChemiDoc XRS型凝膠成像儀（美國伯樂公司）；SPCC－XDS－403型熒光顯微鏡（東莞市譜標實驗器材科技有限公司）；Atellica CH930型全自動生化分析儀（德國西門子公司）。

試藥：阿魏酸鈉（成都亨達藥業有限公司，批號為2018062212）；康復新液（四川好醫生攀西藥業有限責任公司，批號為190519）；結核分枝桿菌H37Rv（中國藥品生物制品檢定所，批號為19080311）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號為P0012），超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（批號為S0101），丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號為S0131S），腫瘤壞死因子－α（TNF－α）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（批號為PT516），白細胞介素6（IL－6）ELISA檢測試劑盒（批號為PI328），白細胞介素1β（IL－1β）ELISA檢測試劑盒（批號為PI303），P38MAPK兔單克隆抗體（批號為AF1111），磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶（p－P38MAPK）兔單克隆抗體（批號為AF5887），c－Jun氨基末端激酶（JNK）兔單克隆抗體（批號為AF1048），磷酸化c－Jun氨基末端激酶（p－JNK）兔單克隆抗體（批號為AF1762），三磷酸甘油脫氫酶（GAPDH）兔單克隆抗體（批號為AF1186），辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（批號為A0208），Annexin VFITC／PI細胞凋亡檢測試劑盒（批號為C1062L），超敏電化學發光（ECL）試劑盒（批號為P0018M），RNA提取試劑盒（批號為R0016），cDNA反轉錄試劑盒（批號為D7160S），胎牛血清（批號為C0227），臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒（批號為C0011），均購自碧云天生物科技有限公司；DMEM培養基（索萊寶科技公司，批號為31600）。

動物：SPF級雄性SD大鼠90只，體質量200～220 g，購于河北醫科大學實驗動物學部，適應性飼養3 d后進行試驗。

1.2 建模、分組與給藥

將90只SD大鼠隨機分為對照組（A組），模型組（B組），阿魏酸鈉低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組）及陽性對照組（D組），每組15只。除A組外，其余大鼠參照文獻［6－7］，尾靜脈注射0.2 mL結核桿菌懸液（質量濃度為5mg／mL），建立肺結核模型。C1組、C2組、C3組大鼠分別按50，100，150 mg／kg劑量灌胃阿魏酸鈉［8］，D組大鼠按10 mL／kg劑量灌胃康復新液［9］，A組及B組大鼠灌胃等量生理鹽水，1次／日。所有大鼠均連續給藥12周［6］。

1.3 觀察指標及檢測

血清TNF－α，IL－6，IL－8水平：將大鼠麻醉后取血清，3500 r／min離心15 min，取上清液，嚴格按試劑盒說明書檢測TNF－α，IL－6，IL－1β水平。

大鼠肺組織SOD活性及MDA水平：處死大鼠，分離肺組織，用生理鹽水灌洗，除去血液后，在勻漿器中勻漿，取勻漿液，按試劑盒說明書中提及方法檢測肺組織SOD及MDA水平。

支氣管肺泡巨噬細胞收集與純化：參考文獻［10］，將大鼠麻醉后切開氣管，取5 mL生理鹽水注入肺組織，重復3次，收集肺泡灌洗液（BALF）（回收率為90%）。取BALF，4℃、800 r／min離心15 min，棄去上清液，取下部細胞，沉淀，并加入磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，使用DMEM培養液（含10%胎牛血清）重懸細胞后，采用臺盼藍染色法計算細胞存活率。＞90%視為大鼠肺泡巨噬細胞收集成功。將收集的肺泡巨噬細胞按照1×108個／L接種于培養皿中，細胞培養箱中培養2 h至肺泡巨噬細胞貼壁，采用瑞氏－姬姆薩染色法鑒定，提取純化得到的貼壁肺泡巨噬細胞（純度＞90%）。

肺泡巨噬細胞凋亡率檢測：使用PBS洗滌3次，加入胰蛋白酶消化后收集肺泡巨噬細胞，1 000 r／min離心5 min，留取下部細胞沉淀，用不含血清的培養基將細胞重懸后，再以2000 r／min的速率離心10 min，取細胞沉淀，棄去上清液，按試劑盒說明書方法，使用AnnexinVFITC結合液及AnnexinV－FITC處理細胞，室溫下避光孵育5 min，再加入10μL碘化丙啶染色液，避光冰浴10 min，上樣至流式細胞儀，測定肺泡巨噬細胞凋亡率。

肺組織病理學檢查：取大鼠肺組織，于中性甲醛中固定24h，經自動組織脫水機脫水、透明處理，于石蠟包埋機中包埋，5μm切片，按常規蘇木精－伊紅（HE）步驟染色，在光學顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理學的變化。

大鼠肺組織JNK，P38MAPK mRNA水平：處死大鼠，取部分肺組織，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，并逆轉錄成cDNA后，按熒光實時定量聚合酶鏈反應（PCR）法檢測GAPDH，JNK，P38MAPK mRNA水平。基因引物見表1，結果采用2－ΔΔCt法分析。

表1 用于實時定量PCR檢測的基因引物序列Tab.1 Primer sequences for real－time quantitative PCR detection

肺組織JNK，p－JNK，P38MAPK，p－P38MAPK蛋白水平：采用蛋白質免疫印跡法，取大鼠肺組織，使用RIPA蛋白裂解液充分裂解，并勻漿，12 000 r／min離心10 min，取上清液，于100℃水浴變性5 min，按BCA試劑盒方法測定各樣品蛋白水平，取60μg蛋白電泳分離，轉膜及封閉液封閉1 h，使用JNK，p－JNK，P38MAPK，p－P38MAPK，GAPDH抗體（1∶1 000）于4℃下孵育12 h，使用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗膜3次，加入二抗（1∶1 000）于室溫下孵育1 h，PBST再次清洗后，使用凝膠成像儀及Image J軟件進行免疫印跡灰度值檢測、分析及定量。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件分析，使用Graphpad prism軟件作圖。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差（One Way ANOVA）分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對血清TNF－α，IL－6，IL－1β水平的影響

與A組比較，B組大鼠的血清TNF－α，IL－6，IL－1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C1組、C2組、C3組、D組大鼠血清的上述指標水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清TNF－α，IL－6，IL－1β水平比較（±s，pg／mL，n＝15）Tab.2 Comparison of serum TNF－α，IL－6，IL－1βlevels of rats in each group（±s，pg／mL，n＝15）

表2 各組大鼠血清TNF－α，IL－6，IL－1β水平比較（±s，pg／mL，n＝15）Tab.2 Comparison of serum TNF－α，IL－6，IL－1βlevels of rats in each group（±s，pg／mL，n＝15）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，＃P＜0.05；與C1組比較，a P＜0.05；與C2組比較，b P＜0.05。表3和表4、圖2和圖4同。Note：Compared with those in group A，*P＜0.05；compared with those in group B，＃P＜0.05；compared with those in group C1，a P＜0.05；compared with those in group C2，b P＜0.05；as well as Tab.3 and Tab.4，Fig.2 and Fig.4.

組別A組B組C1組C2組C3組D組TNF－α 12.85±1.29 78.99±2.34*53.13±1.76＃33.08±2.04＃a 18.52±1.14＃ab 17.15±1.68＃IL－6 26.89±2.75 189.92±1.59*72.25±1.83＃48.01±2.73＃a 31.33±2.27＃ab 35.03±2.68＃IL－1β 13.86±1.54 84.79±1.59*60.09±2.46＃41.08±1.55＃a 26.62±2.82＃ab 23.59±1.62＃

2.2 對肺組織SOD活性及MDA水平的影響

與A組比較，B組大鼠肺組織SOD活性顯著降低（P＜0.05），MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C1組、C2組、C3組、D組大鼠肺組織SOD活性均顯著升高（P＜0.05），MDA水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠肺組織SOD活性及MDA水平比較（±s，n＝15）Tab.3 Comparison of SOD activity and MDA level in lung tissue of rats in each group（±s，n＝15）

表3 各組大鼠肺組織SOD活性及MDA水平比較（±s，n＝15）Tab.3 Comparison of SOD activity and MDA level in lung tissue of rats in each group（±s，n＝15）

組別A組B組C1組C2組C3組D組SOD（U／mgprot）83.34±1.21 36.79±1.65*47.12±1.83＃56.94±2.03＃a 68.92±1.98＃ab 71.34±2.31＃MDA（nmol／mgprot）0.73±0.12 3.11±0.14*2.11±0.08＃1.67±0.04＃a 1.03±0.21＃ab 0.98±0.11＃

2.3 對肺組織巨噬細胞凋亡率的影響

與A組比較，B組大鼠肺組織巨噬細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C1組、C2組、C3組、D組大鼠肺組織巨噬細胞凋亡率均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。詳見圖1和圖2。

圖1 各組大鼠肺組織巨噬細胞凋亡情況（n＝15）Fig.1 Comparison of macrophage apoptosis in lung tissue of rats in each group（n＝15）

圖2 各組大鼠肺組織巨噬細胞凋亡率比較（n＝15）Fig.2 Comparison of macrophages apoptosis in lung tissue of rats in each group（n＝15）

2.4 對肺組織病理學的影響

A組大鼠肺組織未見明顯病理學變化；B組大鼠肺組織可見增生型結核結節，肺間質水腫及大量炎性細胞浸潤、壞死細胞脫落，提示造模成功；C1組、C2組、C3組、D組大鼠肺組織結構恢復，炎性細胞浸潤及壞死細胞脫落明顯減少，肺組織病理學明顯改善。詳見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織病理學檢查結果（HE，×100）Fig.3 Pathological examination results of lung tissue of rats in each group（HE，×100）

2.5 對肺組織JNK，P38MAPK mRNA水平的影響

與A組比較，B組大鼠肺組織JNK，P38MAPKmRNA水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C1組、C2組、C3組、D組大鼠肺組織JNK，P38MAPK mRNA水平均顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。詳見表4。

表4 各組大鼠肺組織JNK，P38MAPK mRNA水平比較（±s，n＝15）Tab.4 Comparison of JNK and P38MAPK mRNA levels in lung tissue of rats in each group（±s，n＝15）

表4 各組大鼠肺組織JNK，P38MAPK mRNA水平比較（±s，n＝15）Tab.4 Comparison of JNK and P38MAPK mRNA levels in lung tissue of rats in each group（±s，n＝15）

組別A組B組C1組C2組C3組D組JNKmRNA 1.06±0.14 5.16±0.27*4.03±0.15＃2.83±0.21＃a 1.34±0.11＃ab 1.55±0.16＃P38MAPKmRNA 0.76±0.08 4.13±0.34*2.89±0.46＃1.57±0.19＃a 0.97±0.14＃ab 1.07±0.23＃

2.6 對肺組織p－JNK，JNK，P38MAPK，p－P38MAPK水平的影響

與A組比較，B組大鼠肺組織p－JNK，JNK，P38MAPK，p－P38MAPK水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C1組、C2組、C3組、D組大鼠肺組織p－JNK，JNK，P38MAPK，p－P38MAPK水平均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）。詳見圖4。

圖4 各組大鼠肺組織p－JNK，JNK，P38MAPK，p－P38MAPK水平比較（n＝15）Fig.4 Comparison of p－JNK，JNK，P38MAPK and p－P38MAPK levels in lung tissue of rats in each group（n＝15）

3 討論

阿魏酸鈉是由從傘形科植物阿魏FerulaassafoetidaL.、川芎Ligusticum chuanxiongHort.根莖、石松科植物卷柏狀石松Lycopodium selagoL.等植物中提取得到的阿魏酸進一步成鹽得到的化合物，具有抗血小板聚集，抑制血小板5－羥色胺釋放，抑制血小板血栓素A2的生成，增強前列腺素活性，抗炎、抗病毒、抗感染等多種藥理作用［3－4］。鐘正靈等［11］研究發現，阿魏酸鈉能明顯抑制脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠體內炎性介質釋放，進而發揮肺組織保護作用。韓靜茵等［12］報道了阿魏酸鈉能拮抗ET病理效應，從而抑制肺部膠原蛋白合成，有效改善塵肺病患者的肺通氣功能，抑制肺纖維化。況菊等［13］報道了阿魏酸鈉能抑制氧化應激誘導的NALP3炎性復合體及成纖維細胞的活性，發揮其對肺組織的保護作用?？祻托乱簭拿乐薮篌垢稍锵x體中提取分離得到，具有通利血脈、養陰生肌功效，用于治療胃、十二指腸潰瘍及陰虛肺癆等疾病。其對肺結核具有明顯的緩解及治療作用，且臨床療效顯著［14］，故本研究中使用康復新液作為陽性對照藥物。

JNK及P38MAPK信號通路均是MAPK信號通路的亞族。MAPK是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者，在細胞因子、神經遞質等多種因素的刺激下被激活，調節細胞對環境的應激適應性及細胞分化等多種生理、病理過程［15］。大鼠肺損傷及肺組織細胞凋亡與JNK及P38MAPK信號通路的過度激活密切相關［16－18］。羅梓垠等［16］研究發現，小鼠肺缺血再灌注時細胞凋亡與JNK及p－JNK水平升高有關。嚴春霞等［17］研究發現，大鼠肺部感染及組織細胞損傷與P38MAPK信號通路異常激活有關。

巨噬細胞在肺結核的發生、發展及疾病預后過程中起重要作用。結核分枝桿菌進入機體后，巨噬細胞通過表面受體識別結核分枝桿菌，進入巨噬細胞后與溶酶體融合，在蛋白酶、溶酶體酶等多種酶的作用下殺死結核桿菌，還能被巨噬細胞呈遞給T淋巴細胞，激活體內特異性免疫過程，而巨噬細胞所產生的高濃度自由基及多種炎性因子也具有殺死結核分枝桿菌的作用［19］。結核分枝桿菌感染者的肺部巨噬細胞達到一定程度后，會引起巨噬細胞的外源性凋亡，這一凋亡會促進巨噬細胞內部結核桿菌的釋放，加重肺部感染［20］。TNF－α，IL－6，IL－1β水平與機體炎性反應的發生、發展相關，其水平升高能激活體內相關信號通路，并調節巨噬細胞的凋亡及自噬；SOD活性及MDA水平是體現組織器官氧化應激水平的指標，SOD活性下降及MDA水平升高提示組織細胞發生了氧化應激損傷。本研究結果表明，與B組比較，C1組、C2組、C3組大鼠血清TNF－α，IL－6，IL－1β水平，肺組織MDA水平，肺泡巨噬細胞凋亡率均顯著降低，肺組織SOD活性均顯著升高，大鼠肺組織病理學明顯改善，提示阿魏酸鈉能顯著改善肺結核大鼠肺組織病理學，降低大鼠炎性因子水平及氧化應激損傷程度。同時，C1組、C2組、C3組大鼠肺組織JNK，P38MAPK mRNA水平及JNK，p－JNK，P38MAPK，p－P38MAPK蛋白水平均顯著降低，提示阿魏酸鈉對肺結核大鼠的保護作用可能與抑制JNK／P38MAPK信號通路的過度激活有關。由于時間及資金等因素的限制，本研究中未對阿魏酸鈉抑制肺泡巨噬細胞凋亡的機制進行深入研究，擬在今后的試驗中對上述問題作進一步探討。

綜上所述，阿魏酸鈉能明顯降低肺結核模型大鼠的炎性因子水平及肺組織氧化應激損傷程度，抑制肺泡巨噬細胞凋亡，改善大鼠肺組織病理學，其作用機制可能與調節JNK／P38MAPK信號通路有關。