痛瀉要方破壁飲片及其傳統飲片對大鼠離體小腸平滑肌收縮的抑制作用*

鄭依玲，梅全喜，歐陽勇，胡 瑩，宋 葉

（1.廣東省廣州市中西醫結合醫院，廣東 廣州 510800； 2.廣東省深圳市寶安純中醫治療醫院，廣東 深圳 518101；3.廣州中醫藥大學附屬中山中醫院，廣東 中山 528401）

痛瀉要方又名白術芍藥散，由炒白術、炒白芍、炒陳皮、防風4味中藥組方，臨床主要用于治療腹瀉型腸易激綜合征、慢性腹瀉、潰瘍性結腸炎等［1］。研究發現，痛瀉要方對家兔、大鼠等試驗動物的離體腸平滑肌具有一定抑制作用［2－3］，但具體作用機制尚不明確，且藥理研究多為中藥傳統飲片，破壁飲片的研究極少。本研究中探討了痛瀉要方破壁飲片及其傳統飲片對大鼠小腸離體平滑肌收縮振幅、頻率及張力的影響，為臨床應用提供參考。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

ISO 510－A型放大器，TRT201A型壓力傳感器，LE 13206 Thermostat型水浴槽和加熱器，均購自美國哈佛儀器公司；PowerLab8／30型生物機能記錄系統，CCA－1112A型冷卻水循環裝置，均購自上海愛朗儀器有限公司；JA1203N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司，精度為千分之一）；TLE204型電子天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為千分之一）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

痛瀉要方破壁飲片（中山市中智藥業集團有限公司，批號為20170125）；白術（批號為20161028），芍藥（批號為20160927），陳皮（批號為20160530），防風（批號為20160803），均為中藥飲片，購自中智大藥房，保存于廣州中醫藥大學附屬中山中醫院藥檢室；乙二醇雙（2－氨基 乙基醚）四乙 酸（EGTA，Scientific Research Special公司，批號為20170502）；維拉帕米（源葉生物公司，批號為Y05J6C2）；氯化鈉（NaCl，批號為1708311），氯化鉀（KCl，批號為1609251），均購自西隴科學股份有限公司；磷酸二氫鉀（KH2PO3，西隴化工股份有限公司，批號為1001041）；無水硫酸鎂（MgSO4，批號為20171008），碳酸氫鈉（NaHCO3，批號為20181109），均購自天津市大茂化學試劑廠；無水氯化鈣（CaCl2，廣東汕頭市西隴化工廠，批號為0705292）；葡萄糖（C6H12O6·H2O，天津歐博凱化工有限公司，批號為1907247）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠10只，雄性，體質量200～300 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK（粵）2018－0002，飼養于廣州中醫藥大學實驗動物中心屏障級實驗室，使用許可證號為SYXK（粵）2012－0125，實驗室內12 h晝夜交替，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～67%，所有大鼠均適應性喂養1周。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 藥液制備

取NaCl（濃度為118 mmol／L）6.896 g，KCl（濃度為4.75 mmol／L）0.354 g，MgSO4（濃度 為1.18 mmol／L）0.142 g，精密稱定，溶于200 mL蒸餾水，為A試劑；取NaHCO3（濃度為24.8 mmol／L）2.083 g，KH2PO3（濃度為1.18 mmol／L）0.161 g，精密稱定，溶于200 mL蒸餾水，為B試劑。取A試劑和B試劑，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz），溶解，將B試劑加入A試劑中，補充蒸餾水至600mL，為AB混合液；取CaCl2（濃度為2.5mmol／L）0.277g，精密稱定，溶于200mL蒸餾水，超聲溶解，為C試劑；于超聲狀態下，在AB混合液中緩慢加入C試劑，用蒸餾水定容至1 000 mL，為ABC混合液；取C6H12O6·H2O（濃度為10 mmol／L）1.982 g，精密稱定，于試驗前加入ABC混合液中，溶解，混勻，于4℃保存待用，即得克氏液。

稱取白術90 g，白芍60 g，陳皮45 g，防風30 g，加10倍量的蒸餾水浸泡30 min，回流提取30 min，8層紗布濾過；藥渣再加10倍量蒸餾水，回流提取30 min，8層紗布濾過，合并濾液，用旋轉蒸發儀濃縮至生藥量為2.813 g／mL，置4℃冰箱保存，待用；試驗時用無Ca2＋的克氏液配制成質量濃度為0.5 g／mL的痛瀉要方傳統飲片溶液。

稱取破壁飲片適量，用無Ca2＋的克氏液溶解，配制成質量濃度為0.5 g／mL的痛瀉要方破壁飲片溶液。

2.1.2 離體小腸平滑肌標本制備

試驗前，恒溫箱溫度恒定在37℃，清洗浴槽2～3次，加入克氏液，37℃預熱。SPF級SD大鼠禁食不禁飲24 h，立即脫臼處死，迅速打開腹腔，找到小腸部位，分離，剪下，將腸內容物用克氏液輕柔沖洗干凈，分別將小腸剪成1 cm長，共8段，立刻浸入盛有4℃克氏液的培養皿中，剪去系膜后制成1 cm長的小腸標本，持續通入95%O2與5%CO2的混合氣體，打開儀器，調好參數，選擇1 g砝碼后將基線調零，定標，將小腸肌條置含有5 mL克氏液、溫度為（37±0.5）℃的離體器官浴槽內，一端連于通氣鉤，另一端連于張力換能器，并持續通入95%O2加5%CO2的混合氣體，使通氣量穩定（氣泡成一條直線）；初始負荷為0.2 g，待肌條適應20 min后，每2 min上調0.2 g，直至1 g，待肌條產生規律恒定的波形后，平衡60 min，先記錄一段正常曲線，再開始試驗［4］。

2.1.3 分組與給藥

每次試驗時剪取同一只大鼠的小腸，共制備8個平滑肌標本，分為痛瀉要方傳統飲片組和痛瀉要方破壁飲片組。在有Ca2＋的克氏液中平衡1 h，加入濃度為60.00mmol／L的高鉀溶液100μL，激動1 cm腸管5 min，換成無Ca2＋的克氏液沖洗3次，平衡60 min，后加入L型鈣通道阻滯劑維拉帕米（濃度為1.00μmol／L）10μL和EGTA（濃度為10－4mol／L）100μL，立即按累積加藥法用無Ca2＋的克氏液配制成質量濃度為0.30，1.00，3.00，6.00，12.00，24.00，36.00，48.00，60.00μg／mL的系列痛瀉要方傳統飲片溶液及其破壁飲片溶液，每隔5 min增加1個質量濃度，取加藥前（即質量濃度為0μg／mL）的收縮情況為空白對照，10 min后向浴槽內加入濃度為2.50 mmol／L的Ca2＋，引起肌條收縮；空白對照組則用同體積無Ca2＋的克氏液代替痛瀉要方傳統飲片溶液及其破壁飲片溶液，其余步驟與給藥組相同。統計并分析小腸平滑肌收縮張力、頻率、振幅變化曲線［5］，按以下公式計算。

張力抑制率（%）＝［（加藥前平均張力－加藥后平均張力）／加藥前平均張力］×100%

振幅抑制率（%）＝［（加藥前平均振幅－加藥后平均振幅）／加藥前平均振幅］×100%

頻率抑制率（%）＝［（加藥前平均頻率－加藥后平均頻率）／加藥前平均頻率］×100%

2.1.4 統計學處理

采用SPSS 21.0統計學軟件分析，GraphPad Prism 5.0軟件畫圖。計量資料采用表示，行單因素方差（One－Way ANOVA）分析，方差齊時組間比較采用Dunnett法，方差不齊時組間比較采用Dunnett′s－T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

表2 3組大鼠小腸平滑肌收縮頻率抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.2 Comparison of inhibition rate of the contraction frequency of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

表2 3組大鼠小腸平滑肌收縮頻率抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.2 Comparison of inhibition rate of the contraction frequency of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

給藥質量濃度（μg／mL）0.30 1.00 3.00 6.00 12.00 24.00 36.00 48.00 60.00空白對照組0.61±0.33 1.13±0.49 1.68±0.56 2.15±0.55 2.96±0.65 3.38±0.82 3.88±0.91 4.91±0.79 5.46±0.86痛瀉要方傳統飲片組1.42±0.71*3.10±0.97**6.25±2.13**9.58±2.15**14.44±3.42**18.36±3.75**21.95±4.25**26.12±5.21**28.77±3.41**痛瀉要方破壁飲片組3.51±1.33**＃＃6.96±1.17**＃＃11.90±3.40**＃＃17.25±3.35**＃＃22.98±4.97**＃＃27.80±5.74**＃＃32.10±6.14**＃＃40.56±6.20**＃＃44.75±4.02**＃

2.2 結果

結果見表1至表3。可見，與空白對照組比較，痛瀉要方破壁飲片組與痛瀉要方傳統飲片組大鼠離體小腸平滑肌收縮的張力、頻率、振幅的抑制作用均顯著增強，且呈劑量依賴性（P＜0.05或P＜0.01）。與痛瀉要方傳統飲片組比較，當給藥質量濃度不低于36.00μg／mL時，痛瀉要方破壁飲片組對大鼠離體小腸平滑肌收縮張力的抑制作用顯著增強（P＜0.05），且呈劑量依賴性（P＜0.05）；當給藥質量濃度不低于0.30μg／mL時，痛瀉要方破壁飲片組對大鼠離體小腸平滑肌收縮頻率、振幅的抑制作用均顯著增強，且呈劑量依賴性（P＜0.05或P＜0.01）。當給藥質量濃度達到60μg／mL時，痛瀉要方傳統飲片組大鼠離體小腸平滑肌收縮張力抑制率為（23.50±6.96）%，收縮頻率抑制率為（28.77±3.41）%，收縮振幅抑制率為（24.04±0.70）%；痛瀉要方破壁飲片組大鼠離體小腸平滑肌收縮張力抑制率為（27.09±8.56）%，收縮頻率抑制率為（44.75±4.02）%，收縮振幅抑制率為（38.23±1.94）%。

表1 3組大鼠小腸平滑肌收縮張力抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.1 Comparison of inhibition rate of the contraction tension of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

表1 3組大鼠小腸平滑肌收縮張力抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.1 Comparison of inhibition rate of the contraction tension of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與痛瀉要方傳統飲片組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。表2和表3同。Note：Compared with those in the blank control group，*P＜0.05，**P＜ 0.01；compared with those in the traditional decoction pieces group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；as well as Tab.2 and Tab.3.

給藥質量濃度（μg／mL）0.30 1.00 3.00 6.00 12.00 24.00 36.00 48.00 60.00空白對照組0.57±0.97 1.01±1.26 1.16±1.16 1.35±1.11 1.58±1.24 1.77±1.22 1.87±1.24 2.41±1.13 2.55±1.11痛瀉要方傳統飲片組1.79±1.13*9.14±5.16**11.32±3.48**11.88±3.55**15.27±3.96**16.10±3.62**17.21±5.59**18.15±7.03**23.50±6.96**痛瀉要方破壁飲片組2.12±0.93*7.72±2.57**11.55±2.70**14.72±3.68**17.86±5.35**20.87±5.87**24.36±6.51**＃26.74±7.81**＃27.90±8.56**＃

表3 3組大鼠小腸平滑肌收縮振幅抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.3 Comparison of inhibition rate of the contraction amplitude of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

表3 3組大鼠小腸平滑肌收縮振幅抑制率比較（±s，%，n＝8）Tab.3 Comparison of inhibition rate of the contraction amplitude of small intestinal smooth muscle among the three groups（±s，%，n＝8）

給藥濃度（μg／mL）0.30 1.00 3.00 6.00 12.00 24.00 36.00 48.00 60.00空白對照組0.45±0.38 0.97±0.61 1.69±0.76 2.32±0.94 2.68±0.55 3.38±0.56 4.08±0.73 4.89±0.95 5.57±1.01痛瀉要方傳統飲片組1.86±0.54**4.00±0.57**6.45±1.20**8.09±0.99**10.90±0.79**13.57±1.01**15.97±1.36**20.70±0.74**24.04±0.70**痛瀉要方破壁飲片組4.63±0.62**＃＃7.98±0.75**＃＃10.36±0.76**＃＃14.20±0.58**＃＃15.70±0.59**＃＃18.37±0.86**＃＃22.61±0.75**＃＃31.47±1.08**＃＃38.23±1.94**＃＃

3 討論

痛瀉要方為治療肝郁脾虛型“泄瀉”的經典方劑，為了突出其主治特點痛瀉而命名為痛瀉要方［1］。《丹溪心法》中白術芍藥散為此方最早的記載，“痛瀉”之方名首見于《醫方考》，其痛瀉之證為脾虛肝郁、木乘土虛、脾失健運所致，治宜止瀉祛濕，抑肝補脾為大法。痛瀉要方中，君藥白術可燥濕補脾，益氣健脾，以治土虛；臣藥白芍平肝柔肝，緩急止痛，與白術相伍，瀉木補土，止痛止瀉，調和肝脾；佐藥陳皮行氣、止痛，健脾、燥濕，對脾胃運化的強化之功最佳；使藥防風為引藥專入肝脾，加強祛風勝濕、止痛之效。全方配伍合理，共奏補脾祛濕止瀉、柔肝止痛功效。相較于傳統飲片，破壁飲片經過超微粉碎技術的破壁處理后，藥材有效成分的溶出率大幅提高，不僅使藥材利用率大大增加，還有效提高了藥材中有效成分的均勻性，且藥品安全性和穩定性較傳統飲片均更易控制；同時，易攜帶，可直接沖水泡服，便于臨床醫師遣方用藥，滿足多方需求［6］。

腸道平滑肌電荷運動的相關活動，主要與Ca2＋，Cl－，Na＋，K＋等離子有關。其中，Ca2＋參與腸道平滑肌的激發－收縮耦聯，直接或間接控制平滑肌的收縮性，是生物細胞重要信息的傳遞使者，可調節平滑肌的收縮狀態，參與調節細胞的多種重要功能［7－8］。［Ca2＋］i的增加是收縮的主要刺激來源［9－10］。細胞外Ca2＋內流在結腸平滑肌收縮中起主要作用，其通道包括通過受體操控性鈣通道（ROCC）、電壓門控鈣離子通道（VGC）、鈣庫調控性鈣離子通道（SOC）［11］。而胃腸道平滑肌主要通過VGC促使細胞外Ca2＋內流，特別是通過L型的VGC進入細胞內［12－13］。

本試驗中，通過加入濃度為60 mmol／L的KCl溶液誘導質膜去極化，從而使VGC通道開放，激活L型Ca2＋通道，細胞外Ca2＋通過L型Ca2＋通道內流進入細胞。維拉帕米是典型的L型鈣通道阻滯劑，當換成無鈣克氏液時，Ca2＋外流，加入維拉帕米阻斷細胞內鈣庫通過L型Ca2＋通道對細胞外Ca2＋的再攝取，使細胞內鈣庫的Ca2＋從細胞內順濃度梯度釋放到細胞外。EGTA是鈣離子螯合劑，能與細胞外Ca2＋螯合。因此，維拉帕米和EGTA合用，可逐漸耗竭細胞外Ca2＋，并阻斷Ca2＋通過VGC進入細胞內。本研究結果顯示，加入痛瀉要方破壁飲片或其傳統飲片后，大鼠離體小腸平滑肌肌條的收縮隨濃度的增大而減小，表明2種飲片可協同維拉帕米阻斷VGC通道，抑制細胞外Ca2＋進入細胞內，并促進細胞內Ca2＋外流，使鈣庫逐漸耗竭，減少肌條收縮活動，減弱小腸平滑肌收縮的張力、頻率、振幅，并呈濃度依賴性，且痛瀉要方破壁飲片的效果要優于其傳統飲片。