高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定甘草總黃酮口腔貼膜中甘草查爾酮A和甘草素含量*

林曉春，李旭桂，張志勤，鄭錦坤，翁立冬△

（1.廣東省粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關(guān) 512025； 2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515）

甘草總黃酮為甘草的主要有效成分，具有顯著抗應(yīng)激、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗自由基損傷、調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、修復(fù)黏膜完整性等多種生物活性作用［1－5］。前期研究中以其為主藥制備了甘草總黃酮雙層緩釋口腔貼膜，所得貼膜生物性能良好［6］，并具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)黏膜完整性修復(fù)的作用，但尚不明確其主要成分和質(zhì)控指標(biāo)。甘草總黃酮的成分包含水溶性和脂溶性，化學(xué)成分有黃酮類、異黃酮類、查爾酮和二氫黃酮類，其中二氫查爾酮和查爾酮是甘草總黃酮的主要成分，且甘草查爾酮A和甘草素分別為其代表成分及活性成分。本研究中建立了同時(shí)測(cè)定甘草總黃酮口腔貼膜中甘草查爾酮A和甘草素含量的高效液相色譜法，為甘草總黃酮口腔貼膜的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；BSA124S型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為萬(wàn)分之一）；KQ－300ES型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

甘草查爾酮A對(duì)照品（批號(hào)為150924，含量為98.5%），甘 草 素 對(duì) 照 品（批 號(hào) 為140827，含 量 為98.8%），均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司；甘草總黃酮口腔貼膜（自制，批號(hào)分別為20181213－01，20181213－02，20181213－03）；乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）；磷酸（分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí)20%A～30%A，10～30 min時(shí)30%A～45%A，30～40 min時(shí)45%A～60%A，40～50 min時(shí)60%A～90%A）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm（0～30 min），365 nm（30～50 min）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

取甘草查爾酮A對(duì)照品和甘草素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，置25 mL容量瓶中定容，分別制成每1 mL甲醇含甘草查爾酮A 208μg、甘草素19.2μg的對(duì)照品溶液。取甘草總黃酮口腔貼膜0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，即得供試品溶液。按樣品制備方法制備不含甘草總黃酮的口腔貼膜，依法制備不含甘草總黃酮的陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液各10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液色譜中，有2個(gè)與對(duì)照品溶液色譜相對(duì)應(yīng)的色譜峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項(xiàng)下含甘草查爾酮A和甘草素的對(duì)照品溶液0.1，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL，加甲醇定容至5.0 mL，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，甘草查爾酮A為Y＝6 135.7X＋31.029（R2＝0.999 9，n＝6），甘草素為Y＝16 529X＋56 197（R2＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，甘草查爾酮A和甘草素的質(zhì)量濃度分別在4.16～166.40μg／mL和0.384～15.360μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限考察：將混合對(duì)照品溶液逐步稀釋后，分別精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，以信噪比（S／N）為3考察檢測(cè)限。結(jié)果甘草查爾酮A和甘草素的檢測(cè)限分別為0.13μg／mL和0.096μg／mL。

精密度試驗(yàn)：精密吸取甘草查爾酮A（142.0μg／mL）和甘草素（16.0μg／mL）的混合對(duì)照品溶液，過(guò)濾，吸取續(xù)濾液10μL，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果甘草查爾酮A和甘草素的平均峰面積分別為3 999.5和1 126.7，RSD為1.11%和1.10%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取0.3 g樣品，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于0，6，12，18，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果甘草查爾酮A和甘草素的RSD分別為0.77%和1.72%（n＝5），表明供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品6份，依法制備供試品溶液，分別精密吸取10μL，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果甘草查爾酮A和甘草素的含量分別為10.225 7 mg／g和0.693 3 mg／g，RSD分別為2.02%和2.45%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗(yàn)：取甘草查爾酮A對(duì)照品和甘草素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，置25.0 mL容量瓶中，配制成混合對(duì)照品溶液（含甘草查爾酮A 105.00μg／mL，甘草素6.50μg／mL），取已知含量的甘草總黃酮膜劑（含甘草查爾酮A 102.426 4μg／mL，甘草素6.9456μg／mL）0.3g，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液0.5，1.0，2.0 mL，置5 mL容量瓶中，精密加入1.0 mL混合對(duì)照品溶液，用甲醇定容至刻度，過(guò)濾，分別取續(xù)濾液10μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.1 Results of the recovery tests（n＝9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批（批號(hào)分別為20181213－01，20181213－02，20181213－03）樣品各0.3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別精密吸取10μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并分別計(jì)算含量。結(jié)果甘草查爾酮A和甘草素的平均含量分別為102.208 3 mg／g和0.693 5 mg／g。

3 討論

3.1 提取方法選擇

甘草總黃酮的含量測(cè)定多采用超聲波提取、微波提取、萃取等方法［7－10］。口腔貼膜以交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉（ALG）、聚乙烯醇為載藥層膜材料，甘草總黃酮分散在緩釋凝膠骨架中，采用超聲提取方法可促使藥物從骨架中充分溶解、釋放，故提取方法確定為超聲提取。

3.2 提取溶劑選擇

考察了不同提取溶液（甲醇、乙醇、70%乙醇、水）下甘草查爾酮A和甘草素的含量，結(jié)果采用甲醇和70%乙醇為提取溶劑時(shí)甘草查爾酮A和甘草素的含量最高，結(jié)合流動(dòng)相的選擇，且載藥膜材料的ALG、甘油、吐溫為水溶性基質(zhì)，70%乙醇可導(dǎo)致基質(zhì)溶解、釋放，進(jìn)而干擾含量的測(cè)定，故提取溶劑確定為甲醇。

3.3 洗脫方法選擇［11－12］

甘草查爾酮A為查爾酮類黃酮，甘草素為二氫黃酮類，兩者極性不同，通過(guò)改變乙腈洗脫濃度，由低到高增加流動(dòng)相極性，可使甘草查爾酮A和甘草素在適宜的保留時(shí)間內(nèi)洗脫出來(lái)，故洗脫方法確定為梯度洗脫。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

甘草查爾酮A和甘草素的最大吸收波長(zhǎng)不同，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇0～30min時(shí)276nm、30～50min時(shí)365nm。

3.5 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，可用于甘草總黃酮口腔貼膜中甘草查爾酮A和甘草素的含量測(cè)定。