總有機碳分析方法用于復方氨基酸（19）丙谷二肽注射液清潔驗證效果考察

2021-06-25 01:53:34申京建

中國藥業 2021年11期

張振，申京建，趙明

（1.首都醫科大學藥學院，北京 100069； 2.北京世橋生物制藥有限公司，北京 101301）

《口服固體制劑：藥品GMP指南》［1］中對清潔驗證提出要求，以避免與設備表面接觸的活性藥物成分和其他藥品產生交叉污染，最大限度地保證患者的用藥安全。目前，多采用高效液相色譜（HPLC）法測定單組分藥品的含量，以進行清潔驗證。但對于復方制劑，尤其是多組分復方制劑，如采用HPLC法，需保證所有組分能有效分離，且各組分均有足夠靈敏度才能保證殘留物質的有效檢出和定量［2］?？傆袡C碳（TOC）法［3］在清潔驗證中，特別是在復方制劑、中藥制劑［4］、生物制品［5］的應用中越來越廣泛。相比HPLC法，TOC法靈敏度更高，分析時間短，且對輔料、清潔劑及未知物質均具有檢出能力［6］。此外，TOC法屬非專屬性方法，只需測定TOC的含量，無需進行各組分的分離，方法更簡易。復方氨基酸（19）丙谷二肽注射液中共有20種氨基酸物質［7］，均可溶于水，由于注射液中N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺的濃度占比最大，故本研究中以N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺為指標物，建立了該注射液生產后清潔驗證樣品的TOC分析法?，F報道如下。

1 儀器、試藥與材料

1.1 儀器

TOC900型總有機碳分析儀（美國GE公司）；BP211D型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01mg）；KH－500DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為140702－201102，純度為99.8%）；聚酯纖維棉簽（深圳市華晨陽科技有限公司，批號為CY715A）。

1.3 材料

10 cm×10 cm的不銹鋼板。

2 方法與結果

2.1 溶液及樣品制備

稀釋劑檢查：量取40 mL稀釋劑（水，TOC的質量濃度小于0.1μg／mL），加入一個TOC小瓶中，并測定TOC。

空白棉簽預處理：取20支棉簽，置1 000 mL燒杯中，量取稀釋劑400 mL浸沒棉簽，密封，超聲10 min，靜置30 min，振搖洗滌1 min，甩去遺留水分，加入稀釋劑400 mL，浸沒棉簽，再振搖洗滌1 min，甩去遺留水分，重復上述操作5次，即得處理過的棉簽（棉簽TOC的質量濃度應小于0.25μg／mL）。

空白棉簽樣品制備：取1根處理過的棉簽，切除末端，放入TOC小瓶中，加入40mL稀釋劑，放置1h，取出，測定。

樣品制備：取1根處理過的棉簽，加稀釋劑浸濕，用1根取樣棉簽按擦拭取樣規程擦拭100 cm2的取樣部位，擦拭路線及方法見圖1。按圖1 A的路線，用棉簽的一側擦拭，擦拭時盡量覆蓋全部面積，用力均勻；使用同1根棉簽的另一面，按圖1B的路線擦拭；依次按圖1 C和圖1 D的路線，用同1根棉簽的不同側面擦拭。擦拭完畢后將棉簽末端切除，放入裝有40 mL稀釋劑的TOC小瓶中，靜置1 h，取出棉簽，將該溶液稀釋10倍后進行測定。

圖1 棉簽擦拭路線及方法Fig.1 Swab wiping route and method

2.2 方法學考察［8－9］

檢測限和定量限考察：將處理過的棉簽（切除末端）放入TOC小瓶中，用40 mL稀釋劑浸泡，靜置1 h，制備10份，取出，測定，記錄TOC響應值。結果響應值的平均值為0.05823μg／mL，標準偏差為5.60；當相對自由度為n－1、自由度為9、置信度為99%時，t為3.25（n＝10）。按公式分別計算檢測限和定量限。檢測限＝t×標準偏差，定量限＝3×檢測限。結果檢測限和定量限分別為0.018 19μg／mL和0.054 47μg／mL。

線性關系考察：取N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺對照品適量，精密稱定，配制質量濃度分別為0.199，0.498，0.996，1.494，1.992，2.988μg／mL的系列對照品溶液，進樣測定，并記錄TOC響應值，以對照品質量濃度（X，mg／mL）為橫坐標、TOC響應值為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y＝362.862 5X＋277.736 3，r＝0.996 8（n＝6）。結果表明，N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺的質量濃度在0.199～2.988μg／mL范圍內與TOC響應值線性關系良好。

擦拭回收試驗［10－11］：取N（2）－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺對照品9.96 mg，精密稱定，用稀釋劑稀釋成質量濃度為1 mg／mL的溶液，作為標準添加液。取3塊10 cm×10 cm的潔凈不銹鋼板，用微量注射器分別均勻滴加標準添加液400，600，800μL，自然風干，平行制備3份，取1根預處理過的棉簽，按2.1項下方法制備樣品，并提取擦拭回收樣品，進樣測定，根據回歸方程計算測得量，依法計算回收率。結果見表1。

表1 擦拭回收試驗結果（n＝9）Tab.1 Results of the wipe recovery test（n＝9）

精密度試驗：按擦拭回收試驗平行制備6份添加600μL標準添加液的樣品，進樣測定。結果TOC響應值的RSD為2.92%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取稀釋劑、空白棉簽溶液及樣品溶液，分別于0和12 h時進樣測定，并依次記錄TOC響應值，考察各溶液的穩定性。結果見表2。

表2 穩定性試驗結果（×10－3μg／mL）Tab.2 Results of the stability test（×10－3μg／mL）

2.3 清潔驗證樣品測定結果

為了確認樣品直接接觸的設備、系統或設施清潔后能保證化學成分和上一批產品可能的殘留物在可接受范圍內［12］，采用風險評估法選取取樣位置［13］，并按2.1項下取樣方式取樣，測定TOC響應值。按照生產流程，涉及設備清潔驗證樣品結果見表3。

表3 清潔驗證樣品檢測結果Tab.3 Results of cleaning validation of the samples

3 討論

3.1 允許殘留限度［14］確定

按10μg／mL標準計算，允許殘留限度為12.04μg／cm2，TOC分析結果使用TOC評判，故需將殘留限度轉換為TOC限值，20種氨基酸中?；撬岬暮剂孔畹蜑?9.2%，則TOC限值＝12.04μg／cm2×19.2%＝2.31μg／cm2。根據樣品制備過程進行折算，則允許殘留限度為2.31μg／cm2×100 cm2÷40 mL÷10＝0.578μg／mL。

3.2 氧化劑流速［15］確定

在TOC試驗中，TOC分析儀通過使用紫外線輻射和化學氧化劑（過硫酸銨），使有機化合物因氧化反應而產生二氧化碳，再分別測定無機碳和總碳以確定TOC。而氧化劑的流速決定了反應中氧化劑用量，流速過低導致分析物不完全氧化；流速過高，可能導致測得的TOC值較低。為了確定最優氧化劑流速，分別考察了氧化劑流速為0，0.1，0.2，0.3，0.4μL／min時的TOC響應值，結果各條件下所得TOC值基本一致。為保證試驗結果的準確性，故將氧化劑流速設置為0.1μL／min。