胃癌合并Hp-L感染患者MIF、MMP-9、VEGF和炎癥因子的表達水平及臨床意義

侯靜芳，楊華，王進海

1.西安交通大學第二附屬醫院消化科，陜西 西安 710004；2.西安市第一醫院老年消化科，陜西 西安 710002

胃癌是臨床上常見的惡性腫瘤，主要發生于胃黏膜上皮，幽門螺桿菌(Hp)感染是該病發生的重要危險因素，據數據顯示，約有60%的胃癌患者合并Hp感染[1]。幽門螺桿菌L型(Hp-L)是Hp的一種變異類型，擁有更強大的致癌作用，也是導致胃癌侵襲、轉移的重要因素，可明顯加劇病情惡化速度[2]。早期了解胃癌患者Hp-L感染發生的危險因素在判斷病情嚴重程度、指導治療方面有重要意義。巨噬細胞移動抑制因子(ΜIF)在促進腫瘤進展方面作用關鍵，參與著正常細胞的分裂、癌基因所誘導的惡性轉化過程[3]?；|金屬蛋白酶-9(ΜΜP-9)對基底膜及細胞外基質中的IV型膠原具有降解作用，可促進新生血管生成，導致腫瘤細胞浸潤、轉移；血管內皮生長因子(VEGF)作為重要的促內皮細胞分裂、促血管生成因子，參與著腫瘤的發生發展過程[4]。此外，胃黏膜炎癥在胃癌的惡化過程中也占據著重要地位，炎癥反應越重則可能提示Hp感染程度越重[5]。因此，本研究通過觀察ΜIF、ΜΜP-9、VEGF及炎癥因子在胃癌合并Hp-L感染患者中的表達水平，并探討其臨床意義?，F將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年2月至2019年2月西安交通大學第二附屬醫院收治的172例胃癌患者進行研究。納入標準：①符合胃癌診斷標準，并通過組織病理學檢查確診[6]；②具有胃癌組織標本以及距離癌組織邊緣＞5 cm的正常胃黏膜組織標本；③初次接受診斷確診，既往未接受過相關抗癌治療。排除標準：①近1個月內使用過質子泵抑制劑、免疫調節劑、抗Hp感染治療等；②合并其余急慢性感染性疾病；③合并出血性疾病；④合并其余惡性腫瘤或者重大軀體疾?。虎萑焉锲诓溉槠?。172例患者中男性101例，女性71例；年齡43～76歲，平均(63.40±7.52)歲。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者均知情并簽署同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 Hp-L感染檢測 將胃癌組織、癌旁組織標本進行常規石蠟包埋切片，結晶紫初染30 s，洗滌，碘液復染1 min后，視野95%乙醇脫色，時間30 s，再次洗滌，稀釋，復紅復染，時間2 min；再次洗滌，使用中性樹膠予以封片，革蘭染色油鏡下觀察，放大倍數10×100，隨機觀察10～15個不同的視野并計算數量，最終結果取平均數，陽性標準細菌L型、Hp均數≥20，陰性標準為＜20或者無L型和Hp陰性[7]；并進行免疫組化(SP)染色，工作濃度1∶80，將磷酸緩沖鹽溶液(PBS)作為陰性對照，已知的陽性切片作為陽性對照，抗Hp-L抗體購于蚌埠醫學院微生物教研室；觀察顯示胃癌細胞、間質巨噬細胞的細胞質或者胞膜中有棕黃色顆粒表達，則判定為Hp-L陽性；當革蘭染色、SP染色檢查結果均顯示為陽性，則最終判定為Hp-L感染[7]。

Hp-L感染程度的判定方式[7]：在顯微鏡下，對胃黏膜黏液層、小凹上皮、表面上皮、腺管上皮表面的L型和Hp情況進行觀察，輕度為：L型和Hp表達少量，僅偶爾發現或者不到標本組織長度的30%；中度：L型和Hp的表達呈連續、稀薄性，在上皮表面有分布，或者到達標本組織長度的31%～60%；重度：L型和Hp的表達量多，已到達標本組織長度的60%以上。

1.2.2 ΜIF、ΜΜP-9、VEGF檢測 ΜΜP-9、抗ΜIF、VEGF單克隆抗體均由武漢博士德公司提供，SP試劑盒由福州邁新該公司提供；采用免疫組化法檢測ΜIF、ΜΜP-9、VEGF陽性率情況，具體方式如下：將切除的胃癌組織、癌旁組織經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，進行4μm連續性切片，SP試劑盒染色，使用檸檬酸緩沖液進行煮沸修復，二氨基聯苯胺法顯色，再使用蘇木素復染，將PBS作為陰性對照，已知的陽性切片作為陽性對照；ΜIF、ΜΜP-9、VEGF的表達均定位在細胞質，根據細胞質類的染色強度、陽性細胞數量進行綜合評價，染色強度無染色則記0分、淡黃色則記1分、棕黃色則記2分、棕褐色則記3分，陽性細胞數量＜5%則記0分、5%～25%則記1分、26%～50%則記2分、＞50%則記3分，將兩者結果相加，總分≥3分則判斷為陽性，＜3分則判斷為陰性[7]。

1.2.3 血清炎癥因子檢測 收集所有患者清晨空腹靜脈血3 mL，室溫下靜置1 h后上離心機離心，轉速3 000 r/min，時間10 min，提取上層清液儲存于-80℃的冷凍箱中待檢。檢測指標包括白細胞介素(IL)-6和IL-1β，試劑盒均購于深圳晶美生物工程有限公司。檢測方式如下：使用IL-6、IL-1β抗體包被酶標板，洗去游離部分后，加入經過辣根過氧化物酶(HRP)所標記的抗人IL-6、IL-1β抗體，洗去游離部分，加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TΜB)進行顯色，在HRP的催化下，TΜB顯示出藍色后，加入終止液，使用酶標儀對吸光度進行測量，并計算血清IL-6、IL-1β濃度的表達。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，相關性采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中Hp-L感染陽性率比較 胃癌組織中Hp-L感染陽性率為69.19%，明顯高于癌旁組織的12.21%，差異具有統計學意義(χ2=115.678，P＜0.05)。

2.2 胃癌Hp-L感染陽性和陰性患者ΜIF、ΜΜP-9、VEGF表達陽性率比較 胃癌Hp-L感染陽性患者ΜIF、ΜΜP-9、VEGF表達陽性率明顯高于Hp-L陰性患者，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 胃癌Hp-L感染陽性和陰性患者的MIF、MMP-9、VEGF表達陽性率比較(例)

2.3 胃癌Hp-L感染陽性和陰性患者血清炎癥因子比較 胃癌Hp-L感染陽性患者血清IL-6、IL-1β的表達水平明顯高于Hp-L陰性患者，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 胃癌Hp-L感染陽性和陰性患者血清炎癥因子比較(±s，pg/mL)

表2 胃癌Hp-L感染陽性和陰性患者血清炎癥因子比較(±s，pg/mL)

組別Hp-L感染陽性Hp-L感染陰性t值P值例數119 53 IL-1β 28.31±3.42 14.07±2.31 27.614＜0.05 IL-6 25.05±3.71 16.23±2.04 16.232＜0.05

2.4 不同Hp-L感染程度患者ΜIF、ΜΜP-9、VEGF及炎癥因子表達水平比較 119例Hp-L陽性感染患者中輕度感染27例，中度感染56例，重度感染36例。重度感染患者的ΜIF、ΜΜP-9、VEGF表達陽性率及血清IL-6、IL-1β水平明顯高于中度和輕度感染患者，中度感染患者上述結果均明顯高于輕度感染患者，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同Hp-L感染程度患者MIF、MMP-9、VEGF及炎癥因子表達水平比較

2.5 Hp-L感染陽性與ΜIF、ΜΜP-9、VEGF及炎癥因子水平的相關性 經Pearson相關性分析結果顯示，Hp-L感染陽性與ΜIF、ΜΜP-9、VEGF、IL-6、IL-1β均呈正相關(P＜0.05)，見表4。

表4 Hp-L感染陽性與MIF、MMP-9、VEGF及炎癥因子水平的相關性

3 討論

Hp常定位于胃黏膜，是導致胃癌發生的重要危險因素，Hp-L是其中的一個變異類型，主要生成于不利于Hp生長的條件之中，即便是在消除相關風險因素后，Hp-L型仍可能持續存在并產生毒性作用，和原菌Hp相比，更具有侵襲性、黏附性和威脅性，且其會持續性的對胃黏膜上皮細胞造成損傷，加速胃癌的進展[8]。

ΜIF的分泌主要來自T淋巴細胞、單核巨噬細胞等，關于其在惡性腫瘤中的作用近年來也備受學者重視；目前的研究發現，ΜIF在諸多腫瘤中均具有更高表達，且可促進腫瘤細胞增殖、分裂、血管生成等，導致病情進展[9]。另也有報道指出，在胃炎、腸上皮化生的胃黏膜、胃癌組織中均能檢測出ΜIF的表達，且表達趨勢呈逐漸遞增表現[10]。ΜΜP-9是ΜΜPs家族的重要成員，在體內被激活后可生成Ⅳ型膠原酶，并對腫瘤表面細胞外基質中的Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白造成破壞，加速腫瘤向周圍組織的浸潤和轉移，且其對血管基底膜具有降解作用，可促進內皮細胞遷移，從而導致新生血管形成[11]。VEGF可在血管內皮細胞中發生特異性的作用，主要可促進內皮細胞增殖，是機體血管形成的重要標志物，其表達的升高可加速腫瘤細胞生長[12]。此外，在胃癌的發生、發展過程中，由于腫瘤細胞會對周圍正常細胞造成損傷，也會加重機體的炎癥反應過程[13]。IL-6、IL-1β均是機體重要的炎性介質，在炎癥信號的刺激下，其表達和發生迅速性的升高，對其的評估有助于判斷機體炎癥狀態。

本研究結果顯示，胃癌組織中Hp-L感染陽性率為69.19%，明顯比癌旁組織要高，和陳聰英等[14]結果具有相似性。而在胃癌Hp-L感染陽性患者中ΜIF、ΜΜP-9、VEGF的陽性率及血清IL-6、IL-1β的表達更高，隨著Hp-L感染程度的加重，這種表達情況更加明顯。在本研究的相關性分析中顯示，Hp-L感染陽性和ΜIF、ΜΜP-9、VEGF、IL-6、IL-1β均呈正相關，通過分析是由于，①Hp-L感染可生成細胞毒素相關蛋白(CagA)、空泡毒素(VacA)等具有毒性的因子，直接在胃黏膜產生作用，加重胃黏膜上皮的損傷程度，促使細胞基因發生突變；YULIZAL等[15]研究顯示，CagA可刺激ΜIF的分泌增加；加上在惡性腫瘤患者中，隨著體內T淋巴細胞、單核巨噬細胞的增加，也同樣會加劇ΜIF的釋放，而隨著ΜIF的增加，又會激活機體發生炎癥反應，此過程可形成一種惡性循環，逐漸導致感染程度加重。②胃癌患者發生Hp-L感染后機體會出現慢性炎癥表現，增加血清IL-6、IL-1β的表達，并持續性的損傷胃黏膜造成損傷，隨著感染程度的加重，可導致組織發生水腫，壓迫到毛細血管，造成局部組織缺氧，此過程會導致VEGF表達的明顯增加，加速內皮細胞生成，繼而又增加ΜΜP-9的大量分泌，各因素之間相互協同、相互促進。但本研究也有不足，例如未觀察上述指標和胃癌患者臨床病理之間的關系等，此后也將持續深入探討。

綜上所述，ΜIF、ΜΜP-9、VEGF、IL-6、IL-1β水平與胃癌Hp-L感染陽性均呈正相關，且隨著感染程度的加重表達越高。