腐殖酸和植物促生芽孢桿菌對黑麥草抗逆性及砒砂巖土壤性狀的影響

曾 仟, 徐雪婷, 張亞見, 鄧 琳, 何琳燕

(1.農業農村部農業環境微生物重點實驗室 南京農業大學 生命科學學院,江蘇 南京 210095; 2.東南大學 土木工程學院, 江蘇 南京 211189)

砒砂巖是一種風化十分嚴重的特殊泥巖和泥砂巖，其抗侵蝕能力非常弱，無水時堅硬如石，遇水松軟如泥，遇風則成砂。砒砂巖地區的水土流失極其嚴重，生態環境非常脆弱，且養分含量低，蓄水能力差，成巖程度低，沙粒間膠結程度差、結構強度低，極其貧瘠，多數植物在其上面都難以生存及生長，因此砒砂巖被稱為“地球生態癌癥”[1]。近年來，我國以沙棘作為著手點，開發了沙棘植物“柔性壩”，有效降低了水土流失。但植物“柔性壩”只能在砒砂巖侵蝕溝的底部應用，傳統人工林和草本植物的種植也很難徹底解決砒砂巖區水土流失問題[2]。因此，砂巖地區的治理難度非常大，防止和控制水土流失的現狀仍然很嚴峻。如何運用新的方法措施改善植物在砒砂巖上的生長情況，探究植物種植與其他方法聯合治理砒砂巖區的可行方案，有效減少水土流失，仍是解決砒砂巖土壤問題的關鍵。

植物促生細菌是一類有益功能性細菌，可以耐受非生物脅迫、刺激根系生長、促進土壤微生物的發育和養分的有效性，改善土壤微環境，在土壤養分循環和土壤結構形成中起著關鍵作用，從而直接或間接地促進植物在脅迫環境下的生長[3]。迄今為止，國內外已發現的植物促生細菌以芽孢桿菌和假單胞菌為主，其中多數芽孢桿菌能夠產生植物激素，提高植物對鹽堿、重金屬和干旱等惡劣條件下的耐受性[4]。嗜鹽芽孢桿菌(BacillushalotoleransP75)是一株植物根際促生細菌，王濤等[5]將菌株P75與其他植物促生細菌混合制成復合菌劑，能夠使砒砂巖土壤有機質和氮磷鉀含量增加，增強土壤酶活性，促進紫花苜蓿的生長，達到改良砒砂巖的效果；同時他們還研究了將菌株P75與草炭、蛭石等生物基材混合制成復合固體微生物菌劑，該復合固體微生物菌劑可以明顯改善砒砂巖土壤性質，促進紫花苜蓿的生長。腐殖酸是一類天然有機物質，能有效改善土壤的生物和物理化學性質，調節土壤水分、肥力。其中黃腐酸能使植物次生根數量增多，提高植物吸水能力，改善植物生長[6]，在緩解多種逆境對作物的脅迫中也具有重要作用[7]。孫海燕等[8]研究表明0.6%濃度的腐殖酸浸種8 h增加了低溫脅迫下菜豆幼苗的抗氧化酶活性，提高了菜豆苗期耐低溫脅迫能力；Rashid等[9]研究了腐殖酸和黃腐酸對污水灌溉鎘污染土壤中小麥品種鎘生物利用度的影響，結果表明，腐殖酸通過與重金屬形成穩定的金屬—腐殖酸配合物來降低金屬的有效性。多年生黑麥草是世界溫帶地區廣泛種植的多年生牧草和適生牧草[10]，具有環境適應性強、易于種植、生長速度快、地上部生物量大、須根發達和抗逆性強等特點，常作為研究土壤修復的供試植物。本研究以多年生黑麥草為供試材料，通過盆栽試驗研究接種BacillushallotoleransP75，施用腐殖酸肥料以及不同菌肥搭配對水土流失嚴重的砒砂巖土壤理化性質及黑麥草生長和抗逆性指標的影響，以期為探究菌肥協同修復作用和機理，為砒砂巖區生物治理提供理論依據及技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為實驗室保藏的BacillushalotoleransP75。LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0。肥料為腐殖酸肥料(Ca+Mg≥150 g/L；N+P2O5+K2O≥100 g/L；黃腐酸≥40 g/L；有機質≥50 g/L)；購買自山西省恒興科技有限公司。供試植物：多年生黑麥草(Loliumperenne)種子購自江蘇省農科院種子站。供試土壤采自內蒙古鄂爾多斯市準格爾旗砒砂巖資源區(39°49′9.97″N，111°16′53.14″E)道路邊坡的風化砒砂巖0—20 cm表層土壤。自然風干后過5 mm標準土壤篩備用。

1.2 發酵液及腐殖酸肥料的制備

將供試菌株B.halotoleransP75單菌落活化，再按2%的比例接種于新鮮LB液體培養基中，30 ℃，160 r/min振蕩培養16～24 h至對數生長期后期，使菌液中細菌濃度達到108CFU/ml，制成P75發酵液，對應滅菌處理則對制得的發酵液進行121 ℃，30 min滅菌。腐殖酸肥料按使用方法稀釋至500倍放置備用。

1.3 盆栽試驗設計

盆栽試驗于2020年5月17日至6月18日在溫室中進行。試驗共設置6個處理，分別為：對照，加等量無菌水(T1)；P75發酵液(T2)；腐殖酸肥料(T3)；P75發酵液+腐殖酸肥料(1∶1，T4)；P75滅菌發酵液(T5)；P75滅菌發酵液+腐殖酸肥料(1∶1，T6)。將風干粉碎過2 mm孔徑篩的砒砂巖土壤裝入塑料花盆內(外口徑10 cm，高8.5 cm，底徑7 cm)，每盆裝土100 g。播種前，將上述制備的發酵液及腐殖酸肥料按10%(體積質量比)接種量將砒砂巖土壤澆灌潤濕，待菌液與砒砂巖混合均勻放置1～2 d后再進行種植。挑選大小基本一致且飽滿的黑麥草種子用75%乙醇表面消毒3～5 min，再用去離子水清洗3次。然后均勻地撒在土壤表面，薄薄蓋土后，放置于室溫黑暗條件下催芽，等種子破土萌發后在室溫條件下16/8 h光照培養，待發芽生長一周后，再用各處理液澆灌。各處理分別設置3個重復，共計18盆。整個盆栽試驗過程中，每天適量澆水保持土壤持水量約60%，并逐漸間苗，最后每盆留苗30株。生長30 d后取樣。

1.4 試驗指標的測定

黑麥草株高：待黑麥草生長30 d時，用尺子挨著地面量到苗頂最高位置，讀數即為黑麥草株高。黑麥草生物量：收獲植株后，用去離子水洗凈瀝干，將黑麥草根和莖葉兩部分的新鮮樣品置于75 ℃烘箱烘干至恒重，稱量其干重。葉片中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性的測定采用氯化硝基四氮唑藍法[11]。葉片中過氧化物酶(Peroxidase, POD)活性的測定采用愈創木酚法[12]。葉片中脯氨酸含量的測定采用磺基水楊酸法[13]。土壤滲水率的測定：在每個盆缽下方接一個小杯，將200 ml水緩緩倒入上方盆缽中，24 h后測量小杯中滲出水的體積V，土壤滲水率=V/200×100%。土壤多糖含量的測定采用硫酸—苯酚法[14]。土壤pH值：取風干過2 mm篩的土壤樣品1 g，按1∶2.5(質量體積比)的比例加入去離子水，充分振蕩2 h后離心，取上清液，pH計測定。土壤有機質含量采用重鉻酸鉀氧化—稀釋熱法[15]。土壤速效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法[16]。土壤速效鉀含量采用NH4OAc-火焰光度法[16]。土壤蔗糖酶活性測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法；脲酶活性測定采用苯酚鈉比色法[17]。

1.5 數據統計與分析

所有試驗數據均采用Excel 2016和GraphPad Prism 8.0.2軟件處理并制圖，采用SPSS 22.0對數據進行單因素方差分析，p<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 腐殖酸和植物促生芽孢桿菌對黑麥草生長的影響

圖1和表1顯示了腐殖酸和菌株B.halotoleransP75對黑麥草生長的影響。從圖1可以看出，與對照T1相比，所有處理均能顯著提高黑麥草的株高和生長狀況，處理T4的促生效果最好。對照T1黑麥草葉片干枯發黃，缺乏營養，施用腐殖酸肥料和接種植物促生細菌后黑麥草葉片明顯變得青綠(圖1)。與對照T1相比，單獨接種P75菌液(T2)和施用腐殖酸肥料(T3)分別使黑麥草株高、地上部和地下部干重增加了26.4%～42.1%，58.3%～62.8%，44.9%～49.7%；將菌株P75與腐殖酸肥料聯合施用(T4)則可以使黑麥草株高、地上部、地下部生物量顯著增加67.1%，127.9%，120.0%(表1)。結果表明，B.halotoleransP75和腐殖酸肥料均可以顯著改善黑麥草在砒砂巖土壤中的生長狀況，二者聯合施用可以進一步促進黑麥草生長。

圖1 腐殖酸和菌株P75對黑麥草生長的影響

表1 腐殖酸和菌株P75對黑麥草生長狀況的影響

2.2 腐殖酸和植物促生芽孢桿菌對黑麥草抗逆性的影響

由圖2可知，與對照T1相比，各處理黑麥草葉片內的SOD活性均顯著升高(p<0.05)。其中，與對照相比，腐殖酸和菌株B.halotoleransP75聯合施用的處理T4使黑麥草葉片SOD活性顯著提高了229.5%；處理T6(P75滅菌發酵液+腐殖酸肥料)的黑麥草葉片SOD活性顯著提高了168.1%；而單獨接菌或施用腐殖酸肥料的處理T2，T3僅分別使黑麥草葉片中SOD活性增加87.9%，74.5%。與對照T1相比，除處理T5(P75滅菌發酵液)外，其余各處理黑麥草葉片中的POD活性均顯著提高(p<0.05)。其中處理T4(P75發酵液+腐殖酸肥料)可以使黑麥草葉片中POD活性顯著提高83.6%，而處理T3(腐殖酸肥料)、T6(P75滅菌發酵液+腐殖酸肥料)、T2(P75發酵液)與空白對照相比分別顯著提高了58.0%，34.4%，16.9%(圖2)。與對照T1相比，各處理黑麥草葉片內的脯氨酸含量均顯著升高(p<0.05)。其中處理T4(P75發酵液+腐殖酸肥料)葉片脯氨酸含量顯著提高了119.3%，而處理T6(P75滅菌發酵液+腐殖酸肥料)、T3(腐殖酸肥料)、T2(P75發酵液)葉片脯氨酸含量也分別顯著提高了110.1%，85.1%，42.5%。以上結果表明，菌株B.halotoleransP75和腐殖酸均使黑麥草葉片中SOD活性、POD活性和脯氨酸含量顯著增加，將二者復配施用則可以進一步提高黑麥草的抗逆性。

注：不同小寫字母表示不同處理間有顯著差異(p<0.05)。下同。

2.3 腐殖酸和植物促生芽孢桿菌對砒砂巖土壤肥力的影響

2.3.1 不同處理對土壤pH值的影響 由圖3所示，與對照相比，除處理T5(P75滅菌發酵液)以外，其余各處理均降低了砒砂巖土壤pH值。P75發酵液降低砒砂巖pH值效果好于腐殖酸，處理T4(P75發酵液+腐殖酸肥料)可以使土壤pH值顯著降低0.30個單位(p<0.05)。

2.3.2 不同處理對根際土壤有機質含量的影響 由圖3可知，與對照相比，單獨施用腐殖酸肥料可使根際土壤有機質含量增加10.1%，而P75滅菌發酵液與腐殖酸混合施用可以使根際土壤有機質含量增加10.7%，單獨施用P75滅菌發酵液對根際土壤有機質含量沒有顯著影響(p<0.05)。當菌株P75與腐殖酸聯合施用可以使有機質含量顯著增加19.5%，說明腐殖酸與微生物可以短時間內增加根際土壤有機質含量。

2.3.3 不同處理對根際土壤速效磷、鉀含量的影響 由圖3可知，與對照相比，處理T3(腐殖酸肥料)、T4(P75發酵液+腐殖酸肥料)、T6(P75滅菌發酵液+腐殖酸肥料)均可以增加砒砂巖根際土壤速效磷含量，其增加幅度為20.7%～66.5%。除處理T5(P75滅菌發酵液)以外，其余處理均增加了根際土壤速效鉀含量，增加幅度為29.7%～48.8%。其中腐殖酸與菌株B.halotoleransP75聯合施用效果最好。

圖3 腐殖酸和菌株P75對砒砂巖土壤pH值、有機質含量、速效磷含量和速效鉀含量的影響

2.3.4 腐殖酸和植物促生芽孢桿菌對砒砂巖土壤酶活性的影響 由圖4可知，與對照相比，除處理T5(P75滅菌發酵液)以外，其余處理均增加了根際土壤酶活性。單獨接菌和施用腐殖酸肥料分別增加了土壤蔗糖酶活性21.9%，12.5%，將二者復合施用的處理T4(P75發酵液+腐殖酸肥料)的效果更好，可使土壤中蔗糖酶活性比對照顯著增加44.9%。與對照相比，處理T3(腐殖酸肥料)可以使土壤脲酶活性增加21.7%，復合處理T4(P75發酵液+腐殖酸肥料)則可以使土壤脲酶活性增加39.5%。結果表明，接菌處理以及施用腐殖酸肥料均可以使砒砂巖土壤酶活性增加，而菌肥復合施用可以進一步提高土壤酶活性。

圖4 腐殖酸和菌株P75對砒砂巖土壤蔗糖酶活性、脲酶活性的影響

2.3.5 不同處理對根際土壤多糖含量的影響 由圖5可知，與對照T1相比，處理T3(腐殖酸肥料)、T4(P75發酵液+腐殖酸肥料)分別使土壤多糖含量顯著提高了171.6%，266.0%(p<0.05)，處理T5(P75滅菌發酵液)與對照相比無顯著性差異(p<0.05)，其余處理的增加幅度為33.9%～114.5%。結果表明，腐殖酸可以顯著提高砒砂巖土壤多糖含量，而將B.halotoleransP75與腐殖酸復合施用的處理效果更好。

2.3.6 不同處理對土壤持水能力的影響 試驗結果表明(圖5)，處理T4(P75發酵液+腐殖酸肥料)的土壤滲水率最低，且土壤滲水率T4(P75發酵液+腐殖酸肥料)

圖5 腐殖酸和菌株P75對砒砂巖土壤多糖含量和滲水率的影響

3 討 論

3.1 腐殖酸和植物促生芽孢桿菌聯合提高黑麥草抗逆性

砒砂巖地區干旱少雨，土壤肥力低下，水土流失嚴重，是大多數植物生長的不良環境。通常在逆境下，植物體內產生并積累自由基和活性氧類物質，對植物細胞的結構和功能造成損傷，提高植物體內的SOD活性可以降低自由基和活性氧的含量，緩解自由基和活性氧帶來的傷害[18]。此外，POD在抗逆性高的植物中活性也更高[19]。脯氨酸是植物體內一種參與滲透調節過程的化學物質，當植物受到干旱脅迫時，植物細胞中脯氨酸會通過吸濕和保水等方面來降低細胞內水分的散失，植物會積累一定量的脯氨酸來保護細胞膜的穩定性、透性，清除植物體內的自由基，保證植物細胞的正常生理代謝活動[20]。因此，脯氨酸是調控植物抵御外界惡劣環境的關鍵生理指標。相同干旱水平下同一品種植物體內脯氨酸含量高的比其相對含量低的抗旱性、旱后恢復性強[21]。

本研究結果表明，生長于砒砂巖逆境中各處理組黑麥草葉片內SOD活性、POD活性、脯氨酸含量均顯著升高。本試驗中接種P75發酵液及施用腐殖酸肥料后黑麥草葉片中各指標均高于對照，且腐殖酸和植物促生芽孢桿菌P75發酵液聯合施用的處理組SOD活性顯著增加，POD活性和脯氨酸含量最高。這主要是因為腐殖酸肥料可以縮小植物氣孔的開張度，降低植物的蒸騰作用，減少植物水分的消耗，從而使植物體內水勢提高，增強植物的抗旱性[22]。此外，腐殖酸肥料還能夠有效增強植物體內多種酶活性，促進根系生長，提高其對水分、養分的吸收，增強植物對微量元素的吸收能力，改善植物生長狀況[23]。另外接菌處理使有益微生物定殖于植物根際周圍，可以通過多種方式調節植物生長，增強植物的抗逆性，例如分泌促進植物發育的代謝物質、改善土壤結構與肥力、提高植物根系對營養元素的吸收與利用等[24]。本試驗中單獨接種B.halotoleransP75對黑麥草的抗逆性及生長情況沒有腐殖酸肥料作用效果好，這可能是由于B.halotoleransP75自身的繁殖能力受到多種因素的影響，在干旱、缺乏營養的砒砂巖土壤環境條件下微生物生長受到一定程度的抑制。因此如何強化微生物在逆境環境中的生存能力仍需深入探討。

3.2 腐殖酸和植物促生芽孢桿菌聯合改良砒砂巖土壤肥力

砒砂巖地區水土流失嚴重，土壤養分低，因此改良砒砂巖土壤肥力是修復砒砂巖的重要環節之一。本試驗中，與對照相比，腐殖酸和植物根際促生芽孢桿菌B.halotoleransP75單獨或協同作用均可以有效提高砒砂巖土壤養分含量和肥力水平，且協同作用更好。腐殖酸肥料和植物促生芽孢桿菌聯合施用的處理明顯改善了砒砂巖土壤的酸堿性，提高了土壤多糖含量、有機質含量及土壤中速效鉀、速效磷含量；同時，土壤酶活性也得到了顯著提高；且土壤滲水率明顯降低，土壤持水能力明顯提高。土壤多糖是土壤中碳水化合物的主要存在方式，是土壤中一種重要的有機膠結物質，土壤多糖不僅是土壤有機質的重要組成部分，而且還可以促進土壤水穩性團聚體的形成，在土壤肥力上具有十分重要的意義[25]。土壤中多糖含量與一些根際土壤酶、土壤微生物總數、土壤基礎肥力呈正相關。本試驗中接種植物促生細菌B.halotoleransP75，使土壤中酶活性和速效磷、速效鉀含量均明顯增加，而滅菌處理組增加土壤肥力效果有限。說明活菌在土壤養分釋放和循環中具有重要意義，能夠在固氮、溶磷、釋鉀等方面發揮重要作用[26]；而且，活菌還可以在植物根系定殖，影響植物根系的生理活動，并參與土壤中營養元素的循環和礦物質的礦化過程。

腐殖酸類肥料是一種綜合性非常強的環保有機肥料，腐殖酸可以調節土壤pH值，提高土壤交換容量，影響土壤中土壤酶的種類和活性特征。土壤中蔗糖酶和脲酶在土壤碳氮元素循環過程中具有非常重要的作用，蔗糖酶可以將土壤中的碳水化合物分解為易溶性的營養物質，供植物和土壤微生物所吸收利用；脲酶則可以促進尿素水解生成氨，為植物生長所需氮素的主要來源[27]。土壤中酶活性的高低也反映了土壤的肥力與土壤微生物活性[28]。在土壤環境中，腐殖酸有著吸附黏連的作用，可以通過不同形式的作用力整合各種類型的有機—無機復合體，以維持土壤的水氣肥熱。同時，腐殖酸還可以有效改善土壤性能，易于穩定土壤的疏松與熟化[29]。本研究中腐殖酸與植物促生芽孢桿菌的聯合進一步強化了腐殖酸的作用，有效改善了砒砂巖土壤養分含量和肥力水平。本研究針對貧瘠的砒砂巖地區，提出微生物與腐殖酸肥料配施強化多年生黑麥草對砒砂巖土壤的改良作用，今后對菌液與腐殖酸肥料的配比和大規模應用還需作進一步探究。

4 結 論

菌株B.halotoleransP75與腐殖酸的聯合施用可以使黑麥草地上部和根部生物量顯著增加，顯著提高了黑麥草的抗逆性，促進黑麥草在砒砂巖土壤中的生長，提高砒砂巖土壤中多糖含量和養分水平及持水能力。植物促生芽孢桿菌B.halotoleransP75與腐殖酸的協同作用可以明顯改善砒砂巖土壤理化性質和肥力，強化植物生長，在砒砂巖地區進行植被修復治理具有潛力。