戊二酸酐酯化κ-卡拉膠的制備及理化性質

陳福泉，陳 思，洪清林，郭東旭，肖 瓊，翁惠芬，肖安風,

(1.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.國家紅藻加工技術研發專業中心，福建廈門 361021；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建廈門 361021；4.福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建廈門 361021；5.綠新（福建）食品有限公司，福建漳州 363100)

κ-卡拉膠(κ-Carrageenan)是一種由二糖結構交替組成的天然線性多糖，具有良好凝膠性、穩定性、增稠性和成膜性，應用于食品、醫藥、化妝品等行業[1]。但κ-卡拉膠在某些產品中應用時，具有易收縮、彈性較小、脆性較大、易析水、乳化性差等缺陷，導致應用范圍受到一定限制。卡拉膠經化學改性，改變其分子結構，可解決上述問題并普遍會賦予其新性能。Zhu等[2]利用過氧化氫制備不同氧化水平的氧化κ-卡拉膠，結果表明氧化κ-卡拉膠可能會破壞細菌細胞壁和細胞膜并有效抑制細菌生長，可用作新型抗菌劑。Dos等[3]制備羧甲基卡拉膠，對腸道炎癥具有一定的治療作用。Hosseinzadeh等[4]通過接枝丙烯酰胺制備一種高吸水性κ-卡拉膠。Matsumoto等[5]采用高氯酸為催化劑，在羧酸/羧酸酐體系中制備κ-卡拉膠酯類衍生物，改善卡拉膠的pH響應性、溶脹性和凝膠性。

戊二酸酐(Glutaric anhydride，GA)是一種化學活性較高的二元羧酸酐[6]，常用于制備淀粉酯改性產品，可提高淀粉增稠力、透明度、低溫粘度、穩定性等性質[7]。而GA用于酯化卡拉膠，目前未見有文獻報道。本實驗通過考察戊二酸酐濃度、反應pH、反應溫度、卡拉膠濃度和反應時間對戊二酸酯化κ-卡拉膠(Glutaric acid esterified carrageenan，GC)的取代度(Degree of substitution，DS)影響，并研究酯化卡拉膠不同取代度對卡拉膠理化性質的影響，為其生產和應用提供理論依據和實際參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

κ-卡拉膠 食品級，綠新(福建)食品有限公司；戊二酸酐 分析純，阿拉丁化學有限公司；氫氧化鈉、濃鹽酸、溴化鉀、乙醇、異丙醇 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；大豆油 益海嘉里食品營銷有限公司。

FE20K酸度計 梅特勒-托利多公司；RO DI digital去離子純水機 杭州匯爾儀器設備有限公司；HH-4電熱恒溫水浴鍋 金壇鴻科儀器廠；7200分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；ZXRDB5210鼓風干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司；FW80高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；WSB-2白度儀 上海昕瑞儀器有限公司；iS50 FT-IR紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司；S4800掃描電鏡 日本日立公司；Q500熱重分析儀 美國TA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 戊二酸酐酯化卡拉膠制備 在200 mL的80%乙醇中配制不同濃度卡拉膠溶液，并在一定溫度進行攪拌至均勻。稱取一定質量戊二酸酐粉末并加入一定體積無水乙醇(w∶v=1∶15)進行溶解。在上述卡拉膠溶液中逐滴滴入戊二酸酐溶液(1 h內完成)，滴加結束之后繼續反應一段時間。整個反應過程中用3%～5%(質量分數)氫氧化鈉溶液保持體系pH維持一定范圍內。反應結束后將產物用95%乙醇洗滌5次之后放入55～60 ℃左右烘箱內干燥12 h，粉碎后即得粉末狀的戊二酸酐酯化卡拉膠。

1.2.2 影響戊二酸酯卡拉膠制備的因素

1.2.2.1 戊二酸酐濃度對產品取代度的影響 在卡拉膠濃度5%(w/v)，反應時間1.5 h，溫度30 ℃，pH8～8.5條件下制備戊二酸酐酯化卡拉膠，考察戊二酸酐濃度(2%、3%、4%、5%、6%，w/v)對產品取代度的影響。

1.2.2.2 反應體系pH對產品取代度的影響 在卡拉膠濃度5%(w/v)，戊二酸酐濃度4%(w/v)，反應時間為1.5 h，反應溫度30 ℃的反應條件下，考察反應pH(7.0～7.5、7.5～8.0、8.0～8.5、8.5～9.0、9.0～9.5)對產品取代度的影響。

1.2.2.3 反應溫度對產品取代度的影響 在卡拉膠濃度5%(w/v)，戊二酸酐濃度4%(w/v)，反應時間1.5 h，體系pH范圍在8～8.5的條件下，考察反應溫度(30、35、40、45、50 ℃)對產品取代度的影響。

1.2.2.4 卡拉膠濃度對產品取代度的影響 在戊二酸酐濃度4%(w/v)，反應溫度為 30 ℃，反應時間為1.5 h，體系pH范圍8～8.5條件下，探究卡拉膠濃度(3.75%、5.00%、6.25%、7.50%、8.75%，w/v)對產品取代度的影響。

1.2.2.5 反應時間對產品取代度的影響 在卡拉膠濃度7.50%(w/v)，戊二酸酐濃度4%(w/v)，反應pH值范圍為8.0～8.5，反應溫度30 ℃的條件下，考察反應時間(1、1.5、2、2.5、3 h)對產品取代度的影響。

1.2.3 取代度測定 稱取1.0 g卡拉膠，先加入5 mL異丙醇將其潤濕，再加入15 mL 2.5 mol/L鹽酸異丙醇在30 ℃下攪拌30 min，之后加入90%異丙醇30 mL繼續反應10 min后抽濾，用95%乙醇洗滌5～6遍直到氯離子完全去除。隨后將濾渣溶解，加入2滴酚酞指示劑，用0.02 mol/L氫氧化鈉滴定至淺粉紅色，并且15 s內不褪色時，記錄消耗氫氧化鈉體積[8]。取代度DS的計算公式如下：

式中：0.306：為卡拉膠二糖分子的摩爾質量，g/mmol；0.114：戊二酸酐的摩爾質量，g/mmol；A：每1 g戊二酸酯卡拉膠所消耗的NaOH的物質的量，mmol。

1.2.4 不同取代度樣品制備條件 戊二酸酐濃度2%，卡拉膠濃度5%，反應時間1.5 h，溫度30 ℃，pH8～8.5條件下制備樣品取代度DS為0.025；戊二酸酐濃度4%，卡拉膠濃度3.75%，反應時間1.5 h，溫度30 ℃，pH8～8.5條 件 下 制 備 樣 品 取 代 度DS為0.037；戊二酸酐濃度4%，卡拉膠濃度5%，反應時間1.5 h，溫度30 ℃，pH8～8.5條件下制備樣品取代度DS為0.048；戊二酸酐濃度4%，卡拉膠濃度7.50%，反應時間1.5 h，溫度30 ℃，pH8～8.5條件下制備樣品取代度DS為0.060；戊二酸酐濃度4%，卡拉膠濃度7.50%，反應時間2.0 h，溫度30 ℃，pH8～8.5條件下制備樣品取代度DS為0.077。

1.2.5 紅外測定 將1.2.4中不同取代度樣品干燥后分別與溴化鉀晶粉以1∶150比例于瑪瑙研缽上研磨混勻后經壓片機壓成薄片，利用Nicolet iS50紅外光譜儀于波數4000～500 cm-1下進行掃描[9]。

1.2.6 白度測定 將1.2.4中不同取代度樣品分別用80目篩過濾后，用白度儀測量樣品白度。

1.2.7 粘度測定 將300 mL 1.5%(其中含有0.2%KCl)不同取代度的卡拉膠體系分別溶解后置于60 ℃恒溫水浴鍋中30 min，待溶液溫度穩定后使用DVC數顯粘度儀進行測定[10]。

1.2.8 熱重測試 采用熱重分析儀在高純氮氣環境中，以5 ℃/min速率于30～800 ℃范圍內進行升溫對卡拉膠粉進行熱重測量[11]。

1.2.9 掃描電鏡 使用掃描電子顯微鏡分析待測卡拉膠粉和卡拉膠凝膠表面形貌。其中凝膠待測樣需要經過約36 h真空冷凍干燥處理[12]。

1.2.10 乳化性及乳化穩定性測定 參照淑苗等[13]的方法：取0.3 g樣品加熱溶于20 mL水中并加入3 mL大豆油，在室溫下以12000 r/min進行高速剪切5 min得到乳液。從燒杯底部取乳液50 μL與25 mL質量分數0.1%的十二烷基磺酸鈉混勻，以質量分數0.1% SDS溶液作空白對照，用紫外分光光度計測定乳液在500 nm處初始吸光值A0，用A0表示乳化性大小，ESI表示乳化穩定性：

ESI=A0×△t/△A

式中，△t=20 min，△A為20 min后乳液吸光值與A0之差。

1.3 數據處理

各組實驗數據均為3次重復實驗的平均值，采用Excel和Origin作圖并進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 影響戊二酸酐酯化卡拉膠取代度的因素

2.1.1 戊二酸酐濃度對卡拉膠取代度的影響 從圖1可知，隨著戊二酸酐濃度由2%增加到6%，DS呈現先增加后下降的趨勢。當戊二酸酐濃度較低時，卡拉膠羥基與戊二酸酐羧基在單位時間內碰撞幾率較低；當戊二酸酐濃度增大時，羧基與卡拉膠羥基的碰撞幾率增大，使酯化反應向正反應進行，因此取代度增大。但當戊二酸酐濃度高于4%后，實驗過程中發現大量堿液的添加引起卡拉膠溶脹造成反應體系難以攪拌均勻，致戊二酸酐遷移速率受阻和酯化反應效率降低，最終導致DS降低[14]。故選擇戊二酸酐濃度為4%，此時DS達到0.048。

圖1 GA濃度對取代度的影響Fig.1 Effects of GA concentration on DS

2.1.2 反應體系pH對卡拉膠取代度的影響 從圖2可知，pH范圍從7.0～7.5增加至8.0～8.5時，DS不斷增加；在pH處于8.0～8.5范圍時，DS達到最大值0.048；隨著pH范圍繼續增長至9.0～9.5，DS值不斷降低。戊二酸酐酯化前，其結構環打開，一端與卡拉膠分子上部分活性較強的羥基發生酯化，另一端形成羧酸，導致反應體系pH下降。為了正反應的正常進行，需不斷加入堿液來維持反應體系的弱堿性。在堿性條件下，多糖分子鏈上的羥基會被活化，更容易與戊二酸酐的羧基發生反應。同時卡拉膠分子間締合作用會因過多的NaOH存在而減弱，其羥基更容易暴露在外面，與戊二酸酐羧基反應幾率增大，因此DS會增加[8]。但NaOH過多時會加速戊二酸酐和堿的接觸，使酸酐上羧基大部分與堿反應生成羧酸鈉甚至會生成羧酸二鈉，減少與卡拉膠上羥基的接觸幾率，導致反應活性部分喪失[15]。此外，卡拉膠在強堿的反應條件下會更加容易吸水溶脹，使反應體系的粘度增加，阻礙酸酐與卡拉膠的結合。所以pH過高時取代度反而會下降。故選擇體系pH范圍為8.0～8.5，此時DS可以達到0.048。

圖2 體系pH對取代度的影響Fig.2 Effects of pH on DS

2.1.3 反應溫度對卡拉膠取代度的影響 從圖3可知，當反應溫度為30 ℃時，DS為最大值0.048，而隨著溫度升高，DS在持續下降，50 ℃時DS值達到最小0.035。因酯化反應是放熱的，溫度越高會阻礙正反應進程而使化學平衡向逆方向進行，加劇反應產物的水解。所以DS隨著溫度的升高會持續下降。故選擇反應溫度為30 ℃，此時DS為0.048。

圖3 反應溫度對取代度的影響Fig.3 Effects of reaction temperature on DS

2.1.4 卡拉膠濃度對卡拉膠取代度的影響 由圖4可知，隨著卡拉膠濃度由3.75%增加至7.50%，DS逐漸增大；當卡拉膠濃度為7.50%時，取代度達到最大值0.060；當卡拉膠濃度繼續增大時，DS有所降低。卡拉膠作為酯化反應的底物，其濃度直接決定反應過程中戊二酸酐與卡拉膠分子接觸面積和觸碰幾率。起初增加卡拉膠濃度時，可增大卡拉膠和戊二酸酐接觸面積，也增大羥基和羧基碰撞幾率，使反應更充分。但隨著卡拉膠濃度進一步增大，取代度反而減小，原因可能是一方面卡拉膠濃度過高以至于難以攪拌均勻，戊二酸酐在體系中分散和遷移受限，阻礙卡拉膠與戊二酸酐的均勻接觸，從而影響反應的進行；另一方面戊二酸酐羧基數量有限，空間位阻效應和斥力作用也會阻礙酯化反應的進行[16]。故選擇卡拉膠濃度為7.50%，此時DS達到0.060。

圖4 卡拉膠濃度對取代度的影響Fig.4 Effects of carrageenan concentration on DS

2.1.5 反應時間對卡拉膠取代度的影響 從圖5可知，當反應時間從1 h增加到2 h時，戊二酸酐酯化卡拉膠的取代度從0.038迅速增加到0.077。隨著反應時間為2～3 h，DS趨于平穩。張本山等[15]也發現戊二酸酸酯化淀粉的DS隨著反應時間的延長先上升后下降。這是由于戊二酸酐與卡拉膠間的酯化反應屬于可逆反應，在酯化反應發生的同時逆反應如戊二酸酐酯化卡拉膠的水解進行[17-18]。在未達到反應動態平衡時，酯化反應占主導，因此DS逐漸增加，直到酯化反應與水解反應均衡，DS變化不大。故選擇反應時間為2 h，此時DS達到最大值0.077。

圖5 反應時間對取代度的影響Fig.5 Effects of reaction time on DS

2.2 紅外分析

不同取代度的卡拉膠紅外譜圖見圖6所示。由圖6可知，戊二酸酐酯化卡拉膠和原卡拉膠(Native carrageenan，NC)的紅外光譜圖所有峰位置都相似，但戊二酸酐酯化卡拉膠在1734 cm-1和1576 cm-1處出現原卡拉膠不存在的吸收峰。兩處峰分別為伸縮振動的酯基和羧基，與戊二酸酐和卡拉膠上羥基酯化后形成一個酯基和一個羧基相符[8]，同時表明卡拉膠與戊二酸酐酯化成功。且隨著DS增加，吸收峰更明顯，與馬喜春等[16]研究的戊二酸淀粉酯紅外光譜的變化一致。

圖6 不同取代度的戊二酸酐酯化卡拉膠紅外光譜曲線Fig.6 Infrared spectrum curve of glutaric acid esterified carrageenan with different DS

2.3 白度測定

卡拉膠是一種天然多糖親水膠，顏色以白色和淡黃色粉末為主，在食品工業中，常作為增稠劑，膠凝劑，懸浮劑及穩定劑等類型食品添加劑[19]，使用時一般要求其不能影響主題產品顏色，正常情況下卡拉膠顏色越白，使用時其影響效果越小。卡拉膠將戊二酸酐酯化后的白度如圖7所示。從圖7可知，酯化產品白度受DS影響波動不大甚至略微增加，主要原因是改性過程中未接觸有色金屬等顯色離子以及不同試劑洗滌作用。表明戊二酸酐酯化卡拉膠在被使用時，將不會對主題產品造成顏色的改變。

圖7 取代度對白度的影響Fig.7 Effect of DS on whiteness

2.4 粘度測定

不同取代度的卡拉膠粘度結果見圖8所示。酯化過程中一方面卡拉膠的分子量降低，另一方面由于引入戊二酸酯取代基后，卡拉膠部分氫鍵斷裂和分子間的作用力減弱，導致粘度最多下降24.8%。但粘度沒有隨DS呈現明顯變化趨勢，是因為粘度還受到pH、溫度等復雜因素引起酯化卡拉膠分子鏈構象及分子間作用力等影響而變化。

圖8 取代度對粘度的影響Fig.8 Effect of DS on viscosity

2.5 熱重分析

原卡拉膠和酯化卡拉膠(DS=0.077)的熱重分析見圖9。由圖9可知，卡拉膠粉末的失重過程主要可概括為兩個階段。第一階段處于30～260℃之間，第二階段則為260～600 ℃。卡拉膠在第一階段的質量損失主要是由于卡拉膠分子內自由水分揮發所致，當溫度達到260 ℃左右時，原卡拉膠與酯化卡拉膠(DS=0.077)質量損失率分別為23%和27%，說明卡拉膠經戊二酸酯化后保水性略有增加。第二階段的重量變化主要是由于卡拉膠組成部分的降解所致，兩種卡拉膠的熱重曲線的轉折點相近，均在270 ℃左右處。表明經酸酐改性處理后的卡拉膠其熱穩定性影響不大，也可推測未對卡拉膠的內部致密結構造成破壞，而主要在其外部表面發生酯化反應。當溫度達到550 ℃時酯化卡拉膠的質量殘留率要高于原卡拉膠，這可能歸因于卡拉膠分子結構中引入了鈉鹽。

圖9 原卡拉膠和酯化卡拉膠的熱重曲線Fig.9 Thermogravimetric curve of NC and GC

2.6 微觀形貌分析

原卡拉膠和酯化卡拉膠(DS=0.077)的微觀形貌見掃描電鏡圖10。從圖10可知，原卡拉膠顆粒表面相對緊實、平坦，經戊二酸改性后粉末顆粒表面變得粗糙，表層出現一定凹陷和孔洞，與戊二酸酯化淀粉顆粒表面出現的形態類似[20]。改性后卡拉膠顆粒表面出現多處由酸酐腐蝕而形成的孔洞。表明戊二酸與卡拉膠的酯化反應主要發生在卡拉膠顆粒表面，進而造成部分卡拉膠顆粒表面侵蝕裂解，進一步驗證了熱重分析推測結果。

圖10 原卡拉膠(A)和酯化卡拉膠(B)的掃描電鏡圖Fig.10 Scanning electron microscopy of NC (A) and GC (B)

2.7 乳化性及乳化穩定性測定

原卡拉膠和酯化卡拉膠(DS=0.077)的乳化性及乳化穩定性見圖11。從圖11可知，卡拉膠經戊二酸酯化后，乳化性和乳化穩定性分別提高了22.5%和28.3%。由于天然卡拉膠疏水部分較少，其乳化能力有限[21]。戊二酸酐環狀結構打開后含有的一些疏水基團嫁接到卡拉膠分子上可提高卡拉膠乳化性。有報道稱較低的油水界面張力可提高均化過程中油滴破碎效率，增加乳化穩定性[22-23]。酯化卡拉膠可能也會減弱油水界面張力，從而其乳化穩定性。戊二酸酐酯化卡拉膠經疏水改性后其乳化能力提高，可應用于微膠囊化脂性物質。

圖11 原卡拉膠與戊二酸酐酯化卡拉膠的乳化性及乳化穩定性Fig.11 Emulsification and stability of NC and GC

3 結論

以κ-卡拉膠作為原料，戊二酸酐為酯化劑，制備戊二酸酐酯化卡拉膠工藝條件以卡拉膠濃度7.5%，戊二酸酐濃度4%、反應時間2 h、反應溫度30 ℃，體系pH在8.0～8.5為宜，制備酯化卡拉膠取代度達0.077；紅外分析結果表明：戊二酸酐酯化卡拉膠紅外圖譜在1720 cm-1處和1576 cm-1出現新吸收峰，證實卡拉膠分子中羥基已與戊二酸酐發生反應生成酯羰基，即卡拉膠酯化成功；卡拉膠經戊二酸酯化后：白度受DS影響波動不大甚至略微增加；表觀粘度儀分析表明粘度有所下降；熱重分析表明熱穩定性變化不明顯；粉末掃描電鏡分析表明改性前后的顆粒表觀形貌發生變化，出現一定凹陷和孔洞，綜合熱重分析結果，認為酯化反應主要發生在顆粒表面。疏水基團嫁接到卡拉膠分子上減弱油水界面張力，使戊二酸酸酐酯化卡拉膠乳化性及乳化穩定性均得到明顯提高。