不同乳酸菌發酵杜仲葉水提液的香氣成分分析

劉夢培，李 佳，靳學遠，王 霞，王維靜，縱 偉,

(1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450002；2.海南科技職業大學臨床醫藥學院，海南海口 571126)

杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，中國傳統中草藥，具有藥食同源性[1]。傳統多以皮入藥，造成數萬噸的杜仲葉腐爛損失[2]。現代藥理研究表明，杜仲葉提取物具有抗炎、抑菌、降血壓及免疫調節等功效[3-5]，且通過對杜仲葉毒理學安全性實驗，驗證了其食用安全性[6]。所以，利用杜仲葉的保健功能來開發功能性食品成為目前研究的熱點。杜仲葉主要化學成分有木脂素類、環烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、多糖等化合物，包含多種單體化合物，在乳酸菌發酵杜仲提取液過程中伴隨著大分子降解、代謝合成和生物轉化等一系列生化反應，產生有益人體健康的新產物，使乳酸菌數量升高的同時，發揮其補益功效[7-8]。向敏等[9]也研究發現乳酸菌發酵可以改善桑葉的青草、腥味等，產生令人愉悅的花果香。因此，本文通過乳酸菌發酵杜仲葉水提物改善其風味，更易被人們接受。目前，對杜仲葉產品的研究較多集中在工藝、營養成分及理化性質等方面，如張麗華等[2]研究了添加不同益生元對植物乳桿菌發酵杜仲鮮葉飲料的影響，王翔等[10]研究了杜仲葉干品的營養價值和抗氧化能力，但對香氣成分研究鮮為少見。

隨著檢測技術的發展，食品揮發性成分常用電子鼻技術(E-nose)和氣相色譜-質譜(GC-MS)等分析方法進行評價。電子鼻是利用氣體傳感器陣列的響應圖案來識別氣味的電子系統，能快速識別簡單和復雜的揮發性成分[11]，與氣相色譜-質譜聯用分析食品的揮發性組分，從而對其總體信息氣味進行全面評估。而同時蒸餾萃取(simultaneous distillationextraction，SDE)法提取揮發性成分具有良好的重復性和較高的萃取量，對微量成分提取效率高，便于定量分析[12]。目前針對杜仲葉揮發性成分分析多采用GC-MS方法分析，研究方向多集中在杜仲皮、葉在有機溶劑中提取的揮發油的成分差異[13-14]，而對杜仲葉提取液發酵后香氣物質的差異性研究尚不深入。因此，本實驗選取4種乳酸菌菌種(植物乳桿菌、德式乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌)，分別對杜仲葉水提液進行發酵，采用SDE-GC-MS與電子鼻技術相結合的方式進行測試分析，探索不同乳酸菌發酵的杜仲葉水提液香氣成分及發酵前后杜仲葉水提液香氣成分的差異性，旨在為杜仲葉發酵食品開發、風味評價及工藝改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 中國林科院杜仲研究基地；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)GIM1.191 中國微生物菌種保藏中心；嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)GIM1.540、德氏乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)GIM1.155、嗜酸乳桿菌(Lactobacillius acidophilus)GIM1.412 廣東省微生物菌種保藏中心；MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；無水硫酸鈉(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；二氯甲烷(色譜純) 天津市富宇精細化工有限公司。

PAL-1數顯折光糖度儀 日本ATAGO公司；BPH-9272型精密恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；JY92-2D型超聲波儀 寧波新芝生物科技有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；HC-3618R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國Airsense公司；7890B-5977A氣相色譜質譜聯用儀 美國安捷倫公司；JY92-2D同時蒸餾萃取裝置 鄭州華峰試劑有限公司；RE-52 AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲葉水提液制備 杜仲鮮葉50 ℃烘箱烘干，杜仲干葉與蒸餾水按1∶20的比例50 ℃超聲提取30 min，雙層紗布過濾[10,15]，加入6%蔗糖(碳源)和1%的菊粉(益生元)，121 ℃滅菌20 min，冷卻至37 ℃左右，涂布平板法檢查無菌后使用。

1.2.2 杜仲葉水提液發酵 將甘油保藏的4種乳酸菌分別按接種量1%(v/v)接種到滅菌后的MRS液體培養基，37 ℃培養48 h，活化2代后菌液離心(4 ℃，6000 r/min，15 min)，傾去培養基，用無菌水洗滌沉淀2～3次后得到菌泥，再將其轉入無菌水中振蕩均勻，活菌數可達到106CFU/mL，接種量4%(v/v)接種到杜仲葉水提液發酵(37 ℃，48 h)。

乳酸菌檢驗參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[16]；杜仲葉發酵液的大腸桿菌檢驗參考GB 4789.3-2016《食品安全國家標準，食品微生物學檢驗，大腸菌群計數》[17]。

1.2.3 電子鼻傳感器檢測 PEN3型電子鼻傳感器由10種金屬氧化物半導體型化學傳感元件組成，不同傳感器的性能描述如表1所示。準確量取5 mL不同樣品，放入樣品瓶，50 ℃水浴10 min后，插入電子鼻探頭吸取頂端空氣，測定揮發性物質。電子鼻的設置參數為：樣品間隔時間1 s，清洗時間100 s，歸零時間5 s，樣品準備時間5 s，測定時間80 s，載氣流速400 mL/min，進樣流量400 mL/min。傳感信號在65 s后基本穩定，選定采集信號時間為70 s，連續測定10次，利用電子鼻自帶的Win Muster軟件對數據進行PCA及LoA。

表1 電子鼻傳感器名稱與其響應物質Table 1 Electronic nose sensors and their response to odorant compounds

1.2.4 SDE法萃取揮發性成分 取250 g杜仲發酵液，放入500 mL單口圓底燒瓶中，加入沸石，置于同時蒸餾裝置重相端，采用電熱套加熱，溫度控制在(100±1)℃范圍內。另取50 mL色譜級二氯甲烷和適量沸石加入到100 mL圓底燒瓶中，置于同時蒸餾裝置輕相端，采用水浴加熱，溫度控制在(55±1)℃范圍內，左側物料開始回流時計時，蒸餾萃取3 h。萃取結束后，收集有機溶劑萃取液，無水硫酸鈉對萃取液進行干燥，冷藏過夜，過濾，將濾液旋轉蒸發濃縮至約2 mL，進行GC-MS檢測。

1.2.5 GC-MS分析條件 GC條件：HP-5MS型石英毛細柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，載氣為He，載氣流量為1.0 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃(保持2 min)，然后以3 ℃/min 的速度升到150 ℃(保持2 min)，再以6 ℃/min 的速率升到220 ℃(保持2 min)。進樣方式：不分流，進樣量0.5 μL。

MS條件：電子離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，全掃描模式，掃描質量范圍為50～550 amu，溶劑延遲3 min。檢索圖庫為NIST 2011。GC-MS測定結果通過NIST 2011圖庫檢索，并用峰面積歸一法測算各化學成分的相對含量。

1.2.6 氣味活度值(ROAV)的計算方法 參考姚遠等[18]的方法，利用相對氣味活度值(ROAV)來描述發酵杜仲葉水提液香氣物質對提取液主體風味的貢獻，ROAV的計算公式如下:

式中，ROAVi代表各香氣組分相對氣味活度值；Ci和Ti分別為各香氣組分的相對含量(%)和香氣閾值(μg/kg)；Cmax和Tmax分別為對樣品風味貢獻最大的香氣成分的相對含量(%)和香氣閾值(μg/kg)。

一般認為，ROAV值越大的組分對樣品總體香氣的貢獻也越大。且ROAV≥1的物質為所分析樣品的關鍵香氣成分。

1.3 數據處理

采用Origin 9.5和SPSS Statistics 32軟件進行處理并制圖。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌發酵杜仲葉水提液的香氣風味區分度分析

2.1.1 主成分分析(PCA) 主成分分析(Principal component analysis，PCA)是一種多元統計方法，用于解釋樣本之間的差異，通過電子鼻傳感器對樣品提取信息，降低數據矩陣的維數，建立了傳感器與風味特征之間的相關性，得出貢獻率最大和最主要的因子[19-20]。一般來說，貢獻率越高，主成分反映原始多指標信息越好，總貢獻率超過85%表明了方法的可行性[21]。從圖1可以看出，第1主成分貢獻率為89.43%，第2主成分貢獻率為10.18%，累積貢獻率為99.61%，大于95%，表明2個主成分已經能夠反映樣品的整體信息，可以代表樣品揮發性風味的主要特征。同時每組樣品測定數據在橫、縱坐標上聚集度較高，說明同組樣品的穩定性和重復性較好[22]。因此，PCA方法適用于不同乳酸菌發酵杜仲葉水提液后樣品揮發性成分分析。

圖1 不同乳酸菌發酵杜仲水提液后揮發性成分PCA圖Fig.1 Linear discriminant analysis of volatile components of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

通過比較各組圖形的的橫縱坐標發現，德式乳桿菌和嗜酸乳桿菌發酵后的杜仲葉水提液第1、2主成分差異不大，說明這兩種菌發酵后的風味較為接近，而未發酵的杜仲葉水提液與其他4種乳酸菌發酵的杜仲葉水提液第1、2主成分差異較為明顯，說明乳酸菌發酵后的風味與其未發酵風味差別較明顯。結合表2所示，區分指數越接近1說明區分度越大，區分越明顯。結合主成分分析圖可以清晰地看出植物乳桿菌發酵組、德式乳桿菌發酵組、嗜酸乳桿菌發酵組、嗜熱鏈球菌發酵組有明顯的區分，且與未發酵組有明顯區別。因此，利用電子鼻來區分不同乳酸菌發酵杜仲葉水提液的風味是非常有效的方法。

表2 不同乳酸菌發酵杜仲水提液電子鼻風味檢測的判別指數Table 2 Discriminant index of e-nose flavor of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

2.1.2 載荷分析(LoA) LoA(Loading Analysis)分析法，主要是對傳感器進行研究，利用該分析法可以確定該實驗條件下傳感器的相對重要性，即樣品區分過程中哪一類氣味起主要區分作用[23]。如圖2所示，若單個傳感器的響應值越偏離于零，說明該傳感器在識別中作用較大，從而確認為識別傳感器[24]，結合圖2可得7號(對硫化物靈敏)和9號(芳香成分，對有機硫化物靈敏)傳感器對第一主成分區分貢獻率最大，6號(對甲基類靈敏)和8號(對醇類、醛酮類靈敏)傳感器對第二主成分區分貢獻率最大；若單個傳感器橫、縱坐標的響應值趨近于零，則此傳感器的識別作用較小可以忽略，即傳感器1、2、3、4、5、10響應較小，對區分所起作用不明顯；總體來說傳感器6、7、8、9號發揮了較大的作用，即未發酵組與4組不同菌種發酵杜仲水提液的風味差異主要體現在硫化物、醇類、醛酮類、芳香類物質等。這表明在進行更深一步分析時，可以著重對響應大的6、7、8、9號傳感器對應的風味化合物種類進行分析。因此，可以通過電子鼻分析來輔助區分不同乳酸菌發酵杜仲葉水提液的風味，與氣相色譜分析法相互驗證。

圖2 不同乳酸菌發酵杜仲水提液后揮發性成分LoA分析圖Fig.2 Loading analysis of volatile components of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

2.2 不同乳酸菌發酵杜仲葉水提液的香氣成分差異性比較

圖3是主要香氣化合物的類別分析。經SDEGC-MS分離和鑒定，未發酵揮發性成分共鑒定出31種，以醛類相對含量最高，為14.36%。4種乳酸菌發酵的杜仲葉水提液揮發性風味物質差異明顯，其中植物乳桿菌發酵后鑒定出的揮發性成分為45種，以酮類相對含量最高，為18.83%；德式乳桿菌發酵后鑒定出的揮發性成分為38種，以雜環類相對含量最高，為24.84%；嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌發酵后鑒定出的揮發性成分分別為43、51種，均以醇類相對含量最高，分別為14.15%和19.03%。乳酸菌發酵對杜仲葉水提液的揮發性物質具有一定的影響，且四種菌種發酵有明顯的區分，主要集中在醇類、醛類、酮類、雜環類物質，這與電子鼻PCA和LoA結果相一致。經乳桿菌發酵后的杜仲提取液，不僅揮發性成分數量較多，且主要香氣成分含量增加顯著，更有利于杜仲葉香氣提升。

圖3 不同乳酸菌發酵杜仲水提液后揮發性成分類別分析Fig.3 Loading analysis of volatile components of water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus species

2.3 不同乳酸菌種發酵杜仲葉水提液的香氣特征分析

不同菌種發酵的杜仲葉水提液在相同條件下用G C-MS檢測的定性和定量結果見表3。

表3 不同乳酸菌發酵杜仲葉水提液后揮發性成分的種類及相對含量Table 3 Species and relative contents of volatile components in Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus

續表3

2.3.1 醇類物質 醇類物質是乳酸菌發酵過程中一類重要的揮發性香氣成分，大部分醇類物質的感知閾值較高，只有少量的高級醇能夠賦予淡雅的花果香氣[30]。4種乳酸菌發酵杜仲葉水提液揮發性成分中醇類物質均含有反-3-己烯醇、3-呋喃甲醇、苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、alpha-松油醇等。與未發酵液相比，苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、alpha-松油醇等香氣成分含量明顯提高。具有青草香氣[29]的反-3-己烯醇，在嗜熱鏈球菌發酵液中相對含量最高為4.9911%；3-呋喃甲醇在植物乳桿菌發酵后相對含量最高，為4.1968%；具有甜果香的苯甲醇和玫瑰香[26]的苯乙醇，在嗜酸乳桿菌發酵液中相對含量較高，分別為5.4991%、2.3751%；具有木青[31]和紫羅蘭香氣[32]的芳樟醇、alpha-松油醇，在德式乳桿菌發酵液中相對含量最高，分別為1.9920%、0.6162%。

2.3.2 醛類物質 醛類物質多為花香及果香，為杜仲葉復雜的清香氣味提供了積極貢獻。4種乳酸菌發酵樣品揮發性成分中醛類物質均有3-糠醛、反式-2-己烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、桂皮醛。具有青香、蔬菜香[32]的反,反-2,4-庚二烯醛在未發酵液中相對含量最高為5.7457%；具有芳香氣[33]的桂皮醛和3-糠醛在植物乳桿菌發酵后相對含量最高，分別為4.5180%、5.0227%；具有綠葉清香[34]的反式-2-己烯醛在德式乳桿菌發酵后相對含量最高，為3.4281%；具有杏仁味及花香[26]的苯甲醛、苯乙醛在嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌發酵后檢測出，而在其它3組中未測出。且嗜熱鏈球菌發酵液中苯甲醛、苯乙醛相對含量較高，分別為2.2924%、1.1134%。

2.3.3 酮類物質 酮類物質性質穩定，并且香氣持久，一般具有花香氣味。4種發酵杜仲葉水提液揮發性成分中共有的酮類物質有大馬士酮、Alpha-大馬酮、二氫-α-紫羅蘭酮、α-異甲基紫羅蘭酮等(前兩者都具有類似玫瑰的芳香，后兩者具有紫羅蘭香氣[35])，但含量差距較大。大馬士酮和二氫-α-紫羅蘭酮在德式乳桿菌發酵液中相對含量最高分別為6.9427%和3.4499%；Alpha-大馬酮在未發酵液中相對含量最高為1.4008%；在所有甲基紫羅蘭酮中香氣最佳[36]的α-異甲基紫羅蘭酮在植物乳桿菌發酵后相對含量最高為0.7623%。

2.3.4 其他類化合物 其他類化合物中雜環類物質在發酵前后的杜仲提取液中相對含量較高，可能是由于SDE法在加熱過程中促使美拉德反應加劇生成一些許多含氮雜環化合物，如呋喃、吡喃、吡咯衍生物等[37]。酯類、酚類、酸類、烴類物質在發酵前后的杜仲提取液所占比例雖然較低，但是因其閾值不同，對杜仲液發酵后的風味同樣起到重要作用。酯類物質多為花、果香。德氏乳桿菌發酵液中酯類物質相對含量較高，占總揮發性成分的2.4596%。具有果香氣[38]的2,4-二叔丁基苯酚在嗜熱鏈球菌發酵液中的相對含量是所有酚類物質里最高(3.5945%)。具有奶酪、酯香味[26]的己酸是植物乳桿菌發酵液特有的物質(相對含量0.5020%)。嗜熱鏈球菌發酵液中檢測到的苯乙烯是烴類物質中相對含量最高的為2.2924%。

2.4 不同乳酸菌種發酵杜仲葉水提液的關鍵香氣成分分析

采用ROAV分析發酵杜仲葉水提液中主要香氣物質對發酵液總體風味的貢獻程度。根據表3中部分發酵液風味物質的香氣閾值和相對含量，以德式乳桿菌發酵液中的大馬士酮為ROAVmax=100，并計算樣品中其它風味物質的ROAV，計算結果見表4。

未發酵的提取液有6種關鍵香氣成分，對其風味貢獻率大小依次為苯乙醛、大馬士酮、芳樟醇、反,反-2,4-庚二烯醛、3-糠醛、反式-2-己烯醛；植物乳桿菌發酵液有7種關鍵香氣成分，對其風味貢獻率大小依次為大馬士酮、3-糠醛、芳樟醇、二氫-α-紫羅蘭酮、桂皮醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反式-2-己烯醛；德式乳桿菌發酵液有7種關鍵香氣成分，對其風味貢獻率大小依次為大馬士酮、芳樟醇、二氫-α-紫羅蘭酮、反式-2-己烯醛、3-糠醛、反,反-2,4-庚二烯醛、桂皮醛；嗜熱鏈球菌發酵液有8種關鍵香氣成分，對其風味貢獻率大小依次為大馬士酮、苯乙醛、芳樟醇、二氫-α-紫羅蘭酮、3-糠醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反式-2-己烯醛、2,4-二叔丁基苯酚；嗜酸乳桿菌發酵液有9種關鍵香氣成分，對其風味貢獻率大小依次為大馬士酮、芳樟醇、3-糠醛、苯乙醛、二氫-α-紫羅蘭酮、對乙烯基愈瘡木酚、反,反-2,4-庚二烯醛、桂皮醛、反式-2-己烯醛，其中對乙烯基愈瘡木酚是嗜酸乳桿菌發酵液所特有的關鍵香氣成分。

大馬士酮、反,反-2,4-庚二烯醛、芳樟醇、3-糠醛、反式-2-己烯醛為5種樣品共有關鍵香氣成分，提供了主體的花香、果香和青葉香。具有綠葉青香的反,反-2,4-庚二烯醛、反式-2-己烯醛在未發酵提取液中貢獻率較高，在發酵后的樣品中明顯下降。另外，發酵后產生獨特花香氣的二氫-α-紫羅蘭酮，說明發酵過程不僅可以增加主體香氣，還可以降低原本杜仲葉的青葉味，產生更濃郁的花香。

3 結論與討論

通過SDE-GC-MS聯用技術對乳酸菌發酵杜仲葉水提液的揮發性成分進行分析，研究結果表明，未發酵杜仲葉提取液的揮發性成分共鑒定出31種，以醛類相對含量最高(14.3591%)；植物乳桿菌發酵后鑒定出的揮發性成分為45種，以酮類相對含量最高(18.8255%)；德式乳桿菌發酵后鑒定出的揮發性成分為38種，以雜環類相對含量最高(25.7828%)；嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌發酵后鑒定出的揮發性成分分別為43和51種，均以醇類相對含量最高(14.1481%和18.3376%)。與未發酵杜仲葉提取液相比，嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌發酵后揮發性成分分別增加20、14、7、12種；4類主要揮發性物質相對含量分別增加了2、2、2.4、1.2倍。因此，經乳酸菌發酵后的杜仲葉提取液，不僅揮發性成分數量較多，且主要香氣成分含量增加顯著，更有利于杜仲葉提取液香氣提升。通過電子鼻分析，PCA和LoA主成分貢獻率均大于95%，香氣成分差異與SDE-GC-MS檢測結果相一致。

由ROAV分析可知，未發酵的杜仲葉提取液關鍵香氣成分有6種，植物乳桿菌、德式乳桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌發酵的杜仲葉提取液關鍵香氣成分依次為7、7、8和9種，其中大馬士酮、反,反-2,4-庚二烯醛、芳樟醇、3-糠醛、反式-2-己烯醛為它們共有的香氣成分。具有綠葉青香的反,反-2,4-庚二烯醛，反式-2-己烯醛在未發酵杜仲葉提取液中含量較高，發酵后顯著下降。另外，發酵后產生獨特花香氣的二氫-α-紫羅蘭酮，不僅可以增加主體香氣，還可以降低原本杜仲葉的青葉味，產生更濃郁的花香。研究結果為杜仲葉相關產品的研發提供了參考依據。

表4 不同乳酸菌發酵杜仲葉水提液后關鍵香氣成分分析Table 4 Analysis of key odor compounds in water extract of Eucommia ulmoides leaf fermented by different Lactobacillus