以黃水為培養基生產細菌纖維素

文 章，何朝玖，陳 才，錢芪云，王橋慧，劉緒興，楊生智，程 鵬，陳 杰,

(1.宜賓六尺巷酒業有限公司，四川宜賓 644000；2.勁牌有限公司，湖北黃石 435000)

細菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)是由微生物合成的由D-葡萄糖分子通過β-1,4-糖苷鍵聚合而成的多孔網狀納米級生物高分子聚合物[1]，其機械穩定性、熱穩定性、高結晶度、高純度(無木質素、半纖維素和果膠等雜質)、低密度、高比表面積、良好的透氣性、高孔隙度、高含水量、保水能力高和良好的生物相容性等獨特優良性質，使其在食品、造紙、紡織、生物醫用材料、光學電子材料等方面都有著廣泛應用[2-3]。BC的生物合成是一個受到多種微生物酶協同調控的復雜代謝過程[4]。糖類和醇類物質是BC生物合成最常用的碳源，葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus)是被用于研究生物合成BC最多的菌種之一，其合成BC的主要途徑見圖1[5]。在不同碳源和生長因子(酵母提取物和蛋白胨)的合成介質中生產BC，成本昂貴，且BC產量低，同時對底物的利用率也不高，這些因素非常不利于BC的工業化大生產和應用。因此，尋找適宜的、價格低廉的原料來降低BC的生產成本是目前研究的重點和熱點。

圖1 木醋桿菌合成纖維素的主要途徑Fig.1 The principal pathway of cellulose synthesis in Gluconacebacter xylinum

近年來，國內外先后報道了許多利用廉價原料生產細菌纖維素的研究。這些原料大多數都是工業和農業副產物，如煙草廢料提取[6]、甜菜糖蜜和奶酪乳清介質[7]、酒廠廢水[8]、玉米漿[9]、果汁[10]、玉米秸稈[11]、荔枝提取物[12]、飲料工業廢物[13]、玉米芯酸水解液[14]、酒糟浸出液[15]、酒糟酶解液[16]、廢啤酒酵母[17]和葡萄酒廢料[18]等。黃水是在中國白酒的釀造過程中糧糟經各類微生物進行復雜分解代謝后產生的含有大量有機酸、可溶性淀粉、酵母溶出物、還原糖、酒精及香味物質的棕褐色的液體[19]。已有的研究表明，黃水中含有的葡萄糖等糖類，乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸，乙醇、丙三醇等醇類均有利于BC生產[7,20-21]。本實驗為探究葡糖醋桿菌利用黃水生物合成BC的可行性，將黃水按照不同稀釋比稀釋后作為培養基，再將葡糖醋桿菌接種培養基中30 ℃靜置培養14 d，發酵結束后測定BC產量、BC產率、BC日均產量、還原糖消耗率、總酸含量、pH值等指標，從而得到最佳的黃水稀釋比，在此基礎上再進一步探究黃水最佳稀釋比下發酵過程中BC產量以及理化指標的變化趨勢，以及不同滅菌方式對BC產量及各項理化指標的影響，從而為葡糖醋桿菌利用黃水發酵生產BC奠定理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter)NZ9 六尺巷酒業有限公司篩選并保藏；新鮮黃水 六尺巷酒業有限公司釀造一車間；對羥基苯苯甲酰肼 東京化成工業株式會社；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、無水檸檬酸、十二水磷酸氫二鈉、瓊脂、氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；HS培養基 葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，無水檸檬酸1.13 g/L，Na2HPO45.0 g/L，pH 6.0，115 ℃滅菌20 min[22]。

PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司；離心機 上海安亭科學儀器廠；電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；恒溫恒濕培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；722型可見分光光度計 上海佑科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃水理化性質測定 從釀造車間黃水坑中取新鮮黃水10 L，于4 ℃冰箱貯存備用。測定黃水總酸含量、pH、還原糖含量、乙醇含量。

總酸含量(以乙酸計)的測定參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》中的方法(下同)；pH的測定參考GB 5009. 237-2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》中的方法(下同)；還原糖含量的測定[23]：采用對羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)試劑法(下同)；乙醇含量的測定參考GB 5009.225-2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中的方法。

1.2.2 不同黃水稀釋比例對BC產量及發酵液理化性質的影響 將黃水直接采用蒸餾水進行稀釋，稀釋比例依次為(黃水∶水，體積比0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，調節pH為6.0，將50 mL培養基分裝于250 mL錐形瓶中，115 ℃滅菌20 min。以HS培養基為對照組，按照10%的接種量將經過3次傳代培養的葡糖醋桿菌NZ19分別接種于以上培養基中，輕輕振蕩，置于30 ℃培養箱中靜置培養14 d，發酵結束后測定發酵液的總酸含量、pH、還原糖消耗量、還原糖消耗率、BC產量、BC平均日產量、BC產率。

1.2.2.1 還原糖消耗量及消耗率 計算公式如下：

1.2.2.2 BC產量的測定 參考文獻[21]，將發酵液中生成的BC膜用純水沖洗浸泡多次，至顏色較淡，再將BC膜置于80 ℃氫氧化鈉(1 mol/L)溶液中浸泡90 min，然后再置于80 ℃蒸餾水中洗滌至中性，置于烘箱中75 ℃烘干至恒質量，稱其質量。BC產量、平均日產量及產率計算公式如下：

1.2.3 發酵過程中BC產量以及理化指標的變化 選擇1.2.2中BC產量最高時的黃水稀釋比例，配制培養基，將50 mL培養基分裝于250 mL錐形瓶中。按照10%的接種量將葡糖醋桿菌NZ19接種到培養基中，以HS培養基作對照，輕輕振蕩，置于30 ℃培養箱中靜置培養14 d，發酵結束后測定發酵液的總酸含量、pH、剩余還原糖含量、還原糖消耗率、BC產率及BC產量。

這樣一來，中糧改變了傳統的糧食貿易中間商角色，發揮起了龍頭企業市場優勢、物流優勢、規模優勢，把農業生產和物流、加工環節對接起來，成為農業生態圈的有機組織者，鏈接起小農戶和大市場。形象地說，這就是打通線上線下全產業鏈的“糧圈兒”。2017年，中糧“糧食銀行+”體系涉地面積40萬公頃，惠及約41萬戶農民，帶動農民增收5949萬元。

1.2.4 不同過濾除菌方法對BC產量及理化指標的影響 將配制好的培養基用0.22 μm濾頭在無菌條件下過濾至已滅菌的錐形瓶中，然后將50 mL無菌培養基分裝于250 mL無菌錐形瓶中。按照10%的接種量將葡糖醋桿菌NZ19接種到培養基中，以HS培養基作對照，輕輕振蕩，置于30 ℃培養箱中靜置培養14 d，發酵結束后測定發酵液的總酸含量、pH、BC產率及BC產量。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復三次，數據采用SPSS 22.0進行顯著性分析，實驗結果表示為平均數±標準差，圖表分析由Excel 2010完成。

2 結果與分析

2.1 黃水成分分析

將從釀造車間取回的新鮮黃水于4 ℃冰箱靜置過夜，待黃水清澈后取上層黃水檢測總酸含量、pH、還原糖含量、乙醇含量，檢測結果見表1。

從表1可知，新鮮黃水中含有還原糖12.43 g/L、總酸5.85 g/L以及乙醇3.61%。由此可知黃水中含有豐富的營養成分。王傳榮[24]指出黃水中含有較多可發酵性糖，以及發酵降解和酵母細胞自溶而得來的蛋白質和氨基酸等，這些碳水化合物和含氮化合物是微生物良好的營養物質。在傳統BC發酵培養基HS培養基中，合成細菌纖維素的前體物質主要來源于葡萄糖，營養物質則來源于蛋白胨、酵母浸粉等。因此，黃水中可供葡糖醋桿菌生長和BC合成的營養物質基本可以與HS培養基基本相當。馬霞等[25-26]研究表明混合糖和有機酸(乙酸、檸檬酸)能夠提高BC產量。張麗平等[27]研究結果表明乙醇、有機酸等多種混合碳源有利于菌株發酵合成BC。李周等[21]研究表明利用黃水-HS培養基靜態發酵生產BC是可行的。因此，白酒釀造副產物黃水具有生產高附加值產品BC的潛在價值。

表1 黃水的理化指標檢測結果Table 1 Detection results of physicochemical indexes of“yellow water”

2.2 不同黃水稀釋比例對BC產量及發酵液理化性質的影響

為探究不同黃水稀釋比對BC產量及發酵液理化性質的影響，直接將經過夜低溫靜置處理的上層黃水按照不同稀釋比例用純水進行稀釋，調節pH 6.0經滅菌后作為BC靜置發酵培養基(未添加任何外源營養物質)。不同黃水稀釋比對BC產量及發酵液中還原糖消耗率的影響情況如圖2所示。

圖2 黃水體積比對細菌纖維素產量和還原糖消耗率的影響Fig.2 Effect of dilution ratio of "yellow water" on bacterial cellulose yield and reducing sugar consumption ratio

隨著黃水稀釋比的減小，BC產量呈現先增加后降低的趨勢。當以純水為培養基時，其仍有BC合成(0.26 g/L)，合成BC的營養物質完全來自接種培養基，這表明葡糖醋桿菌可以利用較低濃度葡萄糖合成BC。其當黃水稀釋比為2∶8時，BC產量達到最高值(2.42 g/L)，比對照組的HS培養基BC產量(1.58 g/L)提高了53.2%。這表明黃水稀釋比為2∶8時最適合BC的合成，此時培養基中的營養物質達到最佳比例。由于黃水中含有豐富的碳源和碳源，其中還原糖、乙酸、乳酸等均能提高BC產量[21]。同時由于黃水中還含有大量的可溶性淀粉，其能適當增加發酵液的黏度，防止菌體與細菌纖維素之間的交聯凝聚，從而使得BC的產量提高[28]。當黃水稀釋比超過2∶8后，隨著稀釋比例的下降，BC產量逐漸下降；當黃水未經稀釋時，培養基中幾乎不產生BC，且稀釋比越低，BC產量下降越明顯。這表明黃水中雖然含有葡萄糖、乳酸等有利于葡糖醋桿菌合成BC的物質，但同樣也含有其他對葡糖醋桿菌生長和抑制BC合成的抑制劑(如糠醛、單寧等)[21,29-30]，當黃水稀釋比例越低，有毒物質的含量越高，對葡糖醋桿菌的毒害作用越大；同時黃水稀釋比例越低，其含有的酸類物質濃度越多，調節pH時消耗的NaOH量就越多，導致培養基集中Na+濃度越高，高離子強度也會抑制葡糖醋桿菌的生長和BC的生物合成[31]。以上這些因素都可能是當黃水稀釋比過低時制約BC合成的原因。隨著黃水稀釋比例的下降，還原糖消耗率逐漸下降，且都顯著低于對照組(78.53%)。當黃水稀釋比在1∶9～3∶7時，還原糖消耗量均維持在66%左右。在黃水稀釋比例為0時(未稀釋)，此時培養基中雖然沒有BC的生成，但是仍有少量(2.21%)的還原糖被消耗，可能是因為接種后葡糖醋桿菌雖然受到培養基中高抑制劑和高鹽濃度的抑制而沒有合成BC，但菌體仍進行了緩慢的生長繁殖，從而消耗了少量的還原糖。以上結果表明，將黃水進行合適的稀釋后，相對于傳統HS培養基能夠明顯提高BC產量，且稀釋比2∶8時，BC產量最高。

檢測不同黃水稀釋比培養基發酵結束后發酵液的BC產率、還原糖消耗量、總酸含量、pH以及BC平均日產量，結果如表2所示。

由表2可知，隨著黃水稀釋比降低，BC產率呈現先增加后降低的趨勢，且所有實驗組BC產率都顯著高于對照組(10.27%)。BC產率高，表明葡糖醋桿菌消耗相同的還原糖能產生更多的BC。隨著黃水稀釋比例降低，BC平均日產量、還原糖消耗量也呈現先增加后降低的趨勢。還原糖消耗量高，而BC產量不高主要是因為葡糖醋桿菌在消耗葡萄糖合成BC的同時，又將葡萄糖轉變成葡萄糖酸和其他酸[31-32]。當稀釋比為2∶8時，BC產率和平均日產量均達到最大值，分別為93.77%，0.174 g·d-1·L-1，相比對照組分別提高了813.05%，53.98%。隨著黃水稀釋比降低，發酵液中酸度和pH逐漸升高；發酵結束后黃水稀釋發酵液pH均在4.39～5.85之間，均顯著高于對照組(pH3.59)(P<0.05)。Keshk等[33]研究表明葡糖醋桿菌生物合成最適pH為4.0～6.0。葡糖醋桿菌以葡萄糖等還原糖作為碳源發酵合成BC時，會通過自身酶系將葡萄糖轉變為葡萄糖酸和其他有機酸[34]，隨著發酵過程的進行，葡萄糖酸等逐漸積累，使發酵培養基pH降低[35]，一旦培養基pH降低到葡糖醋桿菌可耐受pH以下，就會導致菌體代謝活性以及數量降低，最終導致細BC產量下降[36]。稀釋黃水培養基中含有大量有機酸，在以NaOH調節pH后會形成大量強堿弱酸鹽，這些鹽類在培養基中能起到一定的緩沖作用，防止BC合成過程中培養液pH快速下降[21]。同時黃水中糖類、有機酸、醇類等豐富的碳源，能減少葡萄糖酸的產生，這樣既能維持培養液pH穩定，又能促使培養基中的還原糖合成BC，從而提高BC產率[26]。

表2 不同黃水稀釋比培養基發酵結束后理化性質的比較Table 2 Comparison of physicochemical properties of medium with different "yellow water dilution ratio" after fermentation

結果表明，適當黃水稀釋比例可以使發酵液的pH維持在BC合成最佳范圍內，從而有利BC的生物合成，并提高BC產率。當黃水稀釋比為2∶8時，BC產量和BC產率均為最高，因此選擇最佳黃水稀釋比為2∶8進行后續試驗。

2.3 最佳稀釋比例培養基發酵過程中BC產量及理化指標變化

將10%葡糖醋桿菌種子液分別接種于2∶8稀釋比黃水培養基和HS培養基中，30 ℃靜置發酵培養，每兩天取樣測定BC產量和還原糖含量，結果如圖3所示。

圖3 發酵過程中剩余還原糖含量和BC產量Fig.3 Reducing sugar content and BC yield during fermentation

由圖3可知，HS培養基中BC產量在第10 d達到最大值(1.51 g/L)，2∶8稀釋比黃水培養基BC產量在第6 d達到最大值(2.38 g/L)，較HS培養基提前4 d達到最高產量，同時產量也提高了57.62%。HS培養基與2∶8稀釋比黃水培養基中剩余還原糖含量隨著發酵進程的進行，均呈現逐漸較少的趨勢，HS培養基與2∶8稀釋比黃水培養基均在第10 d還原糖含量最低，分別為3.88、1.36 g/L，其中HS培養基中前4 d還原糖含量下降速度最快。結果表明2∶8稀釋比黃水培養基中的葡糖醋桿菌能更快更多地合成BC，這可能是因為黃水含有豐富的營養成分，能促進葡糖醋桿菌的快速繁殖，加快BC的生物合成，從而使培養基中的BC產量快速達到較高水平[21]。同時2∶8稀釋比黃水培養基中消耗更少的還原糖產生更多的BC，這表明葡糖醋桿菌利用了黃水中還原糖以外的其他物質合成BC。

從表3可知，在整個發酵過程中，HS培養基和2∶8黃水稀釋培養基中BC產率均呈現先增加后下降的趨勢，均在第6 d達到最大產率，分別為9.39%和94.16%，2∶8黃水稀釋培養基BC產率較HS培養基提高了9.35倍。HS培養基和2∶8黃水稀釋培養基中還原糖消耗率都呈現出逐漸增加的趨勢，且HS培養基中的還原糖消耗率均高于同時期2∶8黃水稀釋培養基。2∶8黃水稀釋培養基相對于HS培養基中消耗了更少還原糖而產生了更多的BC，這與圖2的結論一致，原因之一是黃水提供了除還原糖以外其他可以促進或用于葡糖醋桿菌生長和合成BC的營養物質或其前提物質，這也解釋了2∶8黃水稀釋培養基中BC產率達到90%以上的原因。在整個發酵過程中，HS培養基中總酸含量逐漸增加，pH逐漸降低，最后降至3.59；而2∶8黃水稀釋培養基總酸先增加后降低，pH在第6天時降至最低，后波動上升，發酵終pH為4.82，說明2∶8黃水稀釋培養基的pH更加穩定，在整個發酵過程中都在葡糖醋桿菌生物合成BC的最適pH范圍內(pH4.0～6.0)[33]。Kuo等[31]指出，雖然葡糖醋桿菌可以利用多種糖來合成BC，但葡萄糖等還原糖對BC的轉化率很低，主要是因為葡萄糖脫氫酶位于細胞膜上，也將葡萄糖等還原糖轉化為細胞外產生葡萄糖酸，從而降低培養物的pH，最終使BC的生物合成受到阻礙，這從另一方面也解釋了HS培養基中糖消耗率高而BC產量較低的原因。2∶8黃水稀釋培養基的pH更加穩定主要原因可能是雖然葡糖醋桿菌在合成BC的過程中伴隨著葡糖糖酸等有機酸類物質的產生，但黃水中的乳酸、乙酸等有機酸及其鹽類能夠起到很好的緩沖作用，避免BC合成過程中發酵液pH出現快速下降，使培養過程保持在合成BC最佳pH范圍內，從而顯著提高BC產量[31]。黃水中的乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸及鹽除了起到緩沖作用之外，這些酸類也能夠進入三羧酸循環或通過經過糖異生途徑合成葡萄糖等方式促進BC合成[37-38]。因此，綜合發酵過程中BC產量、糖消耗率、pH和酸度來看，2∶8黃水稀釋培養基要優于HS培養基，黃水組分起到了良好的緩沖作用和提供豐富的營養物質。

2.4 培養基不同滅菌方式對BC產量及理化指標影響

為探究培養基不同滅菌方式對BC產量及發酵液理化指標的影響，分別將2∶8黃水稀釋培養基采用濕熱高壓滅菌和常溫過濾滅菌后，將10%葡糖醋桿菌種子液分別接種于兩種培養基中，靜置培養14 d，然后測定相應指標，試驗結果見表4。由表4可知，過濾除菌培養基BC產量(3.19 g/L)顯著(P<0.05)高于濕熱高壓滅菌(2.38 g/L)，BC產量提高了34.03%；過濾除菌培養基BC產率(107.56%)顯著(P<0.05)高于濕熱高壓滅菌(92.32%)，BC產量和產率提高了34.03%和16.51%。發酵結束后發酵液酸度和pH無明顯差異。

高溫滅菌造成培養基中的乙醇和乙酸等可揮發性物質損失較大，而過濾除菌對培養基中乙醇和乙酸損失影響較小。Li等[39]指出乙醇氧化所產生的ATP是戊糖磷酸途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶的抑制劑，從而使代謝流量更多的向BC合成方向流入。Sakurai等[40]研究結果也表明葡萄醋桿菌能利用乙醇作為碳源。Hyun等[41]研究也表明，乙醇既可用作為BC合成的碳源，同時低濃度時還會減少葡糖醋桿菌陽性菌突變成不產纖維素陽性菌的概率，并最終提高BC產量。馬霞等[26]研究表明，低濃度的乙酸可彌補葡萄糖降解生成ATP的那部分能量，使得葡萄糖轉化為纖維素的量增加。Mohammadkazemi等[37]研究表明乙酸可以被活化成乙酰輔酶A進入乙醛酸途徑，經糖異生作用形成葡萄糖，而利于BC的生物合成。張麗平等[27]研究也發現乙酸對木醋桿菌合成BC有促進作用。同時，培養基中的乙酸與其他弱酸鹽還能起到很好的pH緩沖作用，避免BC合成過程中產生的葡萄糖酸等酸性物質使得培養基pH急劇下降影響BC的合成。以上這些結果充分表明了不同滅菌方式對提升BC產量有顯著作用，培養基過濾滅菌方式使乙醇、乙酸等揮發性成分損失較少，而這些揮發性成分既有助于BC的合成，又能為BC的合成提供良好的緩沖環境，最終使得過濾滅菌培養基中BC產量明顯高于高壓滅菌方式。

表3 培養基pH、總酸含量、BC產率及還原糖消耗率的變化Table 3 Changes of pH,total acid content,BC yield and reducing sugar consumption of medium

表4 不同滅菌方式對BC產量及理化指標的影響Table 4 Effects of different sterilization methods on BC yield and physicochemical indexes

3 結論

黃水雖然酸度高且pH低，但其含有豐富的營養成分，具有極大的利用價值。將黃水用水進行稀釋制成不同培養基，然后在不同培養基中接種葡糖醋桿菌靜置發酵，發酵結束后測定BC產量和BC產率等理化指標。結果表明，黃水最佳稀釋比為2∶8，此時BC產量最高(2.42 g/L)，比對照組HS培養基BC產量(1.58 g/L)提高了53.2%；BC產率為93.77%，比對照組提高了813.05%。同時發酵結束(14 d)后還原糖消耗率和剩余還原糖含量分別為64.84%和1.36 g/L，均低于同時期的對照組。在不同滅菌方式培養基中，過濾滅菌培養基中BC產量為3.19 g/L，BC產率為107.56%，較高壓濕熱滅菌方式均有明顯提高。因此，以黃水為唯一營養源作為培養基，既能提高BC產量，又降低了BC生產成本，同時也為黃水的開發利用和BC的生產提供了新的途徑。