摩洛哥發酵橄欖汁中乳酸菌的分離鑒定及其多樣性研究

劉文俊，韓 菲，史 迪，劉 琛，柳 青，郭 琳，李 瑜

(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室, 農業農村部奶制品加工重點實驗室，內蒙古自治區乳品生物技術與工程重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018)

橄欖又名青欖、青果，是一種常綠喬木樹種且具有很強的生長能力，橄欖果風味獨特，富含多種活性物質，且極具地域特色，對于改善腸道菌群、養膚護膚以及預防慢性病等方面有著良好的作用[1]。近些年人們開始深入研究橄欖的精加工制品，目前存在的主要產品有果脯蜜餞、橄欖汁、橄欖油等[2]。其中，新型飲料橄欖汁不僅有獨特的口感，而且還具有保肝、醒酒、護喉等功效[3]，深受消費者的喜愛。

眾所周知摩洛哥有橄欖之鄉的美稱，由于摩洛哥地區降水量少，光照充足，所以十分利于橄欖生長。獨特的地域、氣候孕育了獨特的植物、動物和微生物，發酵橄欖汁這一具有獨特地域特色的食品必然有其特有的乳酸菌菌群結構，然而關于發酵橄欖汁中乳酸菌多樣性的研究還未見報道。

傳統植物性發酵食品中孕藏著豐富的乳酸菌資源，其中常見的乳球菌屬中的Lactococcus lactis、乳桿菌屬中的Lactobacillus plantarum在植物性發酵食品和發酵飲料中常常被分離到，并且應用廣泛。例如：任沛東等[4]在自然發酵苦菜中篩選并鑒定出5株高產酸、益生特性較好的植物乳桿菌，可廣泛應用于食品行業的生產；朱珺等[5]篩選出植物乳桿菌581具有潤腸通便功能和良好的發酵特性，可用于具有益生功能的果蔬發酵飲料的開發。在食品行業中乳酸乳球菌由于益生特性較好且可以產生無毒的食品防腐劑乳鏈菌肽而被廣泛應用[6]，在食品行業前景廣闊。因此，從自然發酵食品中分離乳酸菌具有重要研究意義和應用價值。

本文利用純培養方法結合宏基因組16S rRNA測序技術研究摩洛哥地區自然發酵制品中的乳酸菌多樣性，同時采用PacBio SMRT測序技術分析細菌菌群結構，進而保存摩洛哥地區自然發酵制品乳酸菌資源，以期為優良菌株篩選及其工業化應用提供寶貴的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2份發酵橄欖汁樣品 均來自摩洛哥卡薩布蘭卡地區(西經7°41’，北緯33°32’)，將樣品編號為GL1和GL2；TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司；KAPA HiFiHot-StartReady Mix PCR試劑盒 美國KAPA公司；5×TBE電泳緩沖液 天津基準化學試劑公司；實驗所用培養基及其他試劑具體信息 參考文獻[7]。

CDS8000型UPV凝膠成像分析系統 北京賽智創業科技有限公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；ND-1000型微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司；AB/Life梯度PCR儀 美國AB公司；Pacifico SMRT RS II測序平臺 美國PB公司；其他儀器具體信息 參考文獻[7]。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 采集一式兩份發酵橄欖汁樣品，一份加至已有碳酸鈣和可溶性淀粉的無酶無菌采樣管中(m碳酸鈣∶m淀粉=1∶50)，用于樣品中乳酸菌的分離鑒定；另一份加至無酶無菌的樣品采集管中，加入DNA保護劑后，充分混勻，用液氮快速冷凍，密封移至低溫冷采樣箱，采集好的樣品密封并標號，在低溫條件下保存并盡快運回實驗室，用于乳酸菌分離的樣品到實驗室后立即進行菌株分離，用于菌株多樣性測序的樣品冷凍保存后進行DNA提取和后續實驗，并將提取DNA的樣品在-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 乳酸菌的計數 取混勻的0.5 mL樣品于4.5 mL濃度為0.85%的滅菌生理鹽水中，采用稀釋涂布平板法對2份樣品進行乳酸菌活菌計數。取稀釋梯度為10-5、10-6、10-7的稀釋液于玻璃平皿中并加入30 mL加有放線菌酮和多粘菌素的MRS固體培養基采用八字搖勻法搖勻后置于37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養48～72 h。

1.2.3 乳酸菌的分離純化及保存 配制加有0.1%抑菌素(V放線菌酮∶V多粘菌素=1∶1)的MRS和RCM的固體培養基，在121 ℃、15 min的條件下滅菌后使用，在培養基中加入放線菌酮和多粘菌素是為了在培養過程中抑制真菌和霉菌的生長，從而更好地分離出乳酸菌[8]。

采用稀釋涂布平板法，將稀釋梯度為10-5、10-6、10-7的樣品稀釋液均勻涂布在RCM和MRS固體培養基上，37 ℃恒溫厭氧培養48 h[9]。待菌落形成后，觀察菌落形狀、邊緣凹凸情況、光滑度等特征，選取形狀、大小等特征不同的單個菌落，在固體培養基上進行二次劃線純化。實驗過程中發現菌株在MRS固體培養基上生長較好，因此將純化后的單個菌落接種于MRS液體培養基中培養。培養24～48 h后，將培養基離心倒掉上清加0.85%的滅菌生理鹽水進行兩次洗菌。取部分菌體涂片并進行革蘭氏染色，之后在顯微鏡下觀察，將革蘭氏染色陽性，排列均一的菌株暫定為乳酸菌，并在剩余的菌泥中加入脫脂乳保護劑于無菌安瓿管中抽真空冷凍干燥后于-80 ℃保存[10]。

1.2.4 菌株DNA的提取、擴增和系統發育樹的構建 使用TIANampBacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒提取分離純化后并鑒定為乳酸菌的菌株DNA，使用方法詳見試劑盒內說明書。提取完畢后對DNA濃度和純度以及DNA提取質量進行檢測。

將檢測合格的基因組DNA稀釋至100 ng/μL作為PCR擴增模板，進行16S rRNA基因序列擴增[11]。PCR擴增采用通用引物，正向引物27F(5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')，反向引物為1492R (5'-ACCTTGTTACGACTT-3')，PCR反應擴增體系(50 μL)和擴增條件參照喬健敏等[12]的16S rRNA基因序列擴增條件。

擴增完畢后，取約2 μL的PCR擴增產物采用1.0%瓊脂糖凝膠[12]進行電泳檢測。PCR擴增產物在1500 bp處有清晰條帶，并無明顯的拖尾現象，視為16S rRNA基因擴增產物滿足測序要求。將擴增成功的PCR產物，在低溫條件下寄到上海美吉生物技術有限公司，進行雙向測序。

在NCBI數據庫中(National Center for Biotechnology Information)將測序得到的菌株16S rRNA基因序列與模式株進行同源性比對，將同源性結果大于99%的菌株視為與模式菌株屬于同一菌種。用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，進行遺傳進化研究[13]。

1.2.5 樣品宏基因組DNA的提取及文庫構建和上機測序 使用OMEGA eZNA Soil DNA Kit試劑盒提取發酵橄欖汁樣品中基因組的DNA，具體操作參照說明書。檢驗樣品DNA的完整度、純度以及濃度，將合格的樣品置于-20 ℃冰箱備用。

使用KAPA HiFiHotStart Ready Mix PCR Kit將DNA作為模板進行PCR擴增，擴增使用細菌16S rRNA通用引物27F(5-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3')1492R (5'- ACCTTGTTACGACTT-3')，擴增條件和PCR反應擴增體系如下。加入等體積的AMPure? PB 磁珠對擴增產物進行純化，純化后的片段用Qubit＠ dsDNA HS Assay Kit試劑盒檢測DNA濃度，DNA濃度需在20～100 ng/μL。

具體PCR反應擴增體系(50 μL)和擴增條件參照劉文俊等[7]文獻中條件。

經純化后的PCR產物通過Pacific Biosciences SMRT bell TM Template Prep Kit試劑盒構建文庫，用PacBio RS II儀器上機測序，按說明書具體操作，并分析結果[14]。

1.2.6 生物信息學分析 根據標記的Barcode將原始序列劃分到每個樣品中，然后去掉Barcode和引物序列，使用QIIME平臺(v1.70)對高質量的序列進行生物信息學分析。具體分析過程參照劉文俊等[7]生物信息學分析過程。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌計數結果

對摩洛哥地區采集的兩份發酵橄欖汁進行乳酸菌計數，結果為GL1活菌數為2.76±0.02 lg CFU/mL，GL2活菌數為2.92±0.09 lg CFU/mL。

結果表明，采集的2份發酵橄欖汁樣品的乳酸菌活菌數在2.76～2.92 lg CFU/ml之間。可以看出兩份樣品中活菌數相差不大，說明在樣品采集、運輸過程中對樣品的保護較好，并沒有發生較大的活菌損失。

2.2 分離株菌落表型特征

采用純培養方法對本研究中的2份發酵橄欖汁制品進行乳酸菌活菌分離及鑒定，通過顯微鏡觀察、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗將分離到的52株分離菌株初步暫定為乳酸菌，其中包括24株桿菌。在分離過程中觀察菌落形態發現，其表面光滑或粗糙、菌落邊緣整齊、中央有凸起。之后進行革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶陰性，在顯微鏡下觀察顯示，呈單個、鏈狀或分散狀均勻排列(如圖1)，由此初步斷定為乳酸菌。最終篩選出52株乳酸菌，并進行下一步實驗。

圖1 乳酸菌顯微鏡檢圖片(1000×)Fig.1 Micrograph of lactic acid bacteria under microscope(1000×)

2.3 分離株DNA提取及PCR擴增效果分析

提取乳酸菌基因組DNA，并檢測基因組DNA的濃度，結果表明所有分離株的基因組DNA的濃度均在100～1000 ng/L之間，純度值(A260/A280比值)在1.8～2.0范圍內。運用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的質量，結果顯示大約在1500 bp的位置有一條清晰明亮的條帶，該條帶完整性較好，排列較為整齊，明亮且無拖尾(如圖2)，因此菌株基因組PCR產物符合實驗的要求。

圖2 部分分離菌16S rRNA基因的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agar-sugar gel electrophoresis of 16S rRNA gene PCR amplification for partially isolates

2.4 系統發育樹的構建和乳酸菌鑒定結果

測序得到的16S rRNA基因序列應用NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對，如若菌株與模式株序列同源性高于98%可將其歸為同一類。如表1所示，52株菌中，有22株被歸類于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，17株被歸類為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，7株被歸類于干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，6株被歸類于糞腸球菌(Enterococcus faecium)。

表1 摩洛哥地區自然發酵橄欖汁中乳酸菌分離株數量Table 1 The number of isolates of lactic acid bacteria in naturally fermented olive juice in Morocco

將52株自然發酵橄欖汁中乳酸菌分離株的16S rRNA基因序列，經GenBank數據庫上傳。

Neighbor-Joining系統發育樹和菌株遺傳進化比對結果如圖3所示。本研究將52株分離株鑒定為乳酸菌的3個屬4個種。IMAU98344、IMAU98358等菌株與模式菌株Lactobacillus paracaseisubsp.paracaseiATCC 25302T(D79212.1)聚為一類，故將其鑒定為Lactobacillus paracasei。IMAU98077、IMAU98141等菌株與模式菌株Lactococcus lactissubsp. lactisATCC 19435T(AB100803.1)聚為一類，且同源性為99%，故將其鑒定為Lactococcus lactissubsp.lactis。IMAU98357、IMAU98360等菌株與模式菌株Lactobacillus plantarumATCC 14917T(AF404710.1)聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Lactobacillus plantarum。菌株IMAU98386與模式菌株Enterococcus faeciumATCC 19434T(AB012213.1)聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Enterococcus faecium。

圖3 摩洛哥地區自然發酵橄欖汁中部分分離株的16S rRNA基因序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of the isolates from naturally fermented olive juice in Morocco

由表1可以看出，共分離出52株乳酸菌，其中樣品GL1共分離出24株，包含11株Lactobacillus plantarum，2株Lactobacillus casei(paracasei)，9株Lactococcus lactis，2株Enterococcus faecium。樣品GL2共 分 離 出28株 乳 酸 菌，包 含13株Lactococcus lactis，6株Lactobacillus plantarum，5株Lactobacillus casei(paracasei)，4株Enterococcus faecium，各樣品菌株豐富度比較見圖4。

2.5 發酵橄欖汁中細菌群落結構

通過對PacBio SMRT測序所得序列進行篩選后，本研究中兩份樣品基因組DNA中共獲得2501條高質量的序列，在門水平上，共檢測到5個細菌門分別是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcu-Thermus)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，平均相對含量分別是83.61%、14.67%、1.00%、0.62%、0.08%；在屬水平上，共鑒定到40個細菌屬，主要菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)。如圖5所 示，樣 品GL1Lactobacillus的 相 對 含 量 為48.61%，Lactococcus的相對含量為27.10%，樣品GL2Lactobacillus的相對含量為61.69%，Lactococcus的相對含量為18.41%。相對含量大于1%的菌屬還包括Shigella、Escherichia、Pediococcus、Acinetobacter、Pseudomonas等。在種水平上，共鑒定到80個細菌種，主要菌種有Lactococcus lactis、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus casei等，其中GL1的相對含量分別為21.43%、14.52%、9.22%、4.98%，GL2的相對含量分別為23.83%、19.00%、7.46%、10.78%(如圖6)。

2.6 優勢種屬分析

2份摩洛哥發酵橄欖汁樣品共分離出52株乳酸菌，分別為4個種。比較純培養方法與PacBio SMRT測序檢測方法，兩種方法鑒定到的菌種屬相對含量比較如表2所示，運用純培養方法與PacBio SMRT測序檢測方法鑒定出的最優勢菌屬均為Lactobacillus，分別占比為46.15%、55.15%；在種水平上兩份樣品共分離出22株Lactococcus lactis，占總分離株的42.31%，基于PacBio SMRT測序檢測方 法 鑒 定 出Lactococcus lactis占 比 最 高，為22.63%，說明Lactococcus lactis為摩洛哥地區發酵橄欖汁制品中乳酸菌的優勢種。其次還分離出16株Lactobacillus plantarum、7株Lactobacillus casei(paracasei)和6株Enterococcus faecium，占比分別為32.69%、13.46%和11.54%。由表2結果可以看出PacBio SMRT測序檢測方法檢測出Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei(paracasei)、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus zeae、Enterococcus faecium和Pediococcus acidilactici，占比分別為0.04%、7.88%、16.76%、8.34%、7.21%、0.04%和4.13%，其中Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus zeae和Pediococcus acidilactici等 在純培養的過程中均沒有被分離出，原因可能是這些菌種活菌含量較少，在純培養時沒形成優勢菌，所以沒有挑取到相應菌落。純培養方法與PacBio SMRT測序檢測方法檢測出Lactobacillus plantarum含量差異較大，分別為32.69%和0.04%，出現此差異的原因可能在于兩份樣品中Lactobacillus plantarum活菌含量較高，導致在菌落隨機挑選過程中，增加了其挑取比例，Lactobacillus plantarum菌種挑選的太多，因此相對含量占比很大。

圖4 摩洛哥地區自然發酵橄欖汁中乳酸菌分離株豐富度比較Fig.4 The comparison of richness of lactic acid bacteria in natural fermented olive juice in Morocco

圖5 樣品中主要乳酸菌屬水平的相對含量分析Fig.5 The relative abundance of lactic acid bacteria in the sample based on genera level

圖6 樣品中主要乳酸菌種水平的相對含量分析Fig.6 The relative abundance of lactic acid bacteria in the sample based on species level

對比結果發現樣品的優勢屬和優勢種存在差異，純培養方法和PacBio SMRT 16S rRNA基因測序技術分離出的優勢菌屬為Lactobacillus占比分別為46.15%和55.15%，而優勢菌種為Lactococcus lactis，占比分別為42.31%和22.63%。觀察表2可以發現，純培養方法分離出的Lactobacillus和Lactococcus百分比含量差異并不大，分別為46.15%和42.31%。PacBio SMRT16S rRNA測序檢測方法在Lactobacillus中檢測出的菌種種類很多，因此菌屬相對百分比含量很高，但在Lactococcus中檢測出的菌種只有Lactococcus lactis且含量占比很高，因此通過百分比含量來看，優勢屬為Lactobacillus，優勢種為Lactococcus lactis，但比較分析純培養方法和PacBio SMRT測序檢測方法分離出的菌株可以看出，在摩洛哥地區采集的發酵橄欖汁樣品中乳桿菌屬具有菌種多樣性，而乳球菌屬菌種比較單一。

表2 發酵橄欖汁中不同方法獲得的主要乳酸菌種屬含量比較Table 2 Comparison of main lactic acid bacteria species content obtained by different methods in fermenting olive juice

3 討論

在本研究中，采用純培養方法與PacBio SMRT 16S rRNA基因測序技術對摩洛哥地區采集的發酵橄欖汁樣品進行了細菌群落分析，早期純培養的出現主要是為了解決研究者在研究過程中面臨的多種微生物共存的復雜局面，目前我國對傳統發酵食品中微生物的研究仍然主要應用微生物純培養技術[15]，但是純培養技術存在人為挑選誤差而導致菌種分離不全的情況，因此在對樣品研究時結合宏基因組PacBio SMRT 16S rRNA基因測序技術可以更完整地研究樣品中的菌種多樣性。

在本文中利用傳統純培養技術和PacBio SMRT 16S rRNA基因測序技術主要分離出的Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum和Lactobacillus casei(paracasei)廣泛存在于各類發酵食品中。例如在傳統乳制品、發酵蔬菜汁、酸菜、馬奶酒、發酵泡梨、發酵肉制品、酸奶等都分離出植物乳桿菌[16]。丁馮玲等[17]對12份云南泡梨樣品進行菌種分離與鑒定，鑒 定 出79株Lactobacillus plantarum、3株Lactobacillus casei(paracasei)，Lactobacillus plantarum為發酵泡梨中的優勢菌；高璇等[18]在新疆酸馬奶中共分離鑒定出20株對萬古霉素具有耐受性的乳桿菌，其中L.plantarum為優勢種。Lactobacillus casei(paracasei)是摩洛哥自然發酵制品中純培養得到的優勢菌種之一。研究表明干酪乳桿菌可以提高宿主免疫力且具有顯著的益生效果[19]。本研究也分離到了腸球菌，腸球菌的存在主要有兩個方面的原因。首先，腸球菌是植物源食品中的常見乳酸菌分離株；其次，橄欖汁為自然發酵生產，可能存在發酵過程中污染的問題。隨著消費者對橄欖制品的青睞，橄欖制品中豐富乳酸菌資源的潛在益生功能和其他特性將會被進一步深入研究。

4 結論

本文運用傳統純培養分離鑒定方法從摩洛哥卡薩布蘭卡地區采集的自然發酵橄欖汁樣品中共分出52株菌株，鑒定為3個屬，4個種，其中Lactococcus lactis為優勢菌種，占總分離株的42.31%。應用三代測序技術對樣品宏基因組測序分析，檢測到5個門、40個屬、80個細菌種，其中包括Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus casei(paracasei)等乳酸菌菌種，Lactococcus lactis為優勢菌種，占總分離株的22.63%。本研究獲得了自然發酵橄欖汁中的乳酸菌資源，為優良乳酸菌的開發利用提供了寶貴的菌株。通過兩種方法全面地了解摩洛哥地區自然發酵橄欖汁制品中豐富的乳酸菌組成及豐度。此研究結果不僅可以豐富乳酸菌的菌種資源，可以為后期自然發酵食品中乳酸菌的研究提供基礎數據。