重組人汗腺抗菌素蛋白的異源可溶表達、發酵優化及分離純化研究

馬文君，郭校燕，滕 琳，王培培，衛宏遠，鄭春陽

(1.天津大學，天津 300350；2.天津強微特生物科技有限公司，天津 300384；3.舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司，北京 101100；4.守正創新生物科技（天津）有限公司，天津 300384)

一些食品添加劑如亞硝酸鹽和二氧化硫等化學防腐劑的過量使用可能會對人體健康和食品營養水平造成不良影響[1]。由于過度使用化學防腐劑，細菌產生了耐藥性，因此迫切需要尋找新的天然防腐劑來保存食品[2]?？咕氖菑V泛存在于動植物、昆蟲和細菌中的一類天然細胞多肽[3]。使用抗菌肽作為生物防腐劑對食品進行保鮮，可以同時提高食品的貨架期和對人體的安全性[4-5]。它可以保護宿主免受病原微生物的侵害。抗菌肽的發現有望成為化學防腐劑的替代品，其中乳鏈菌肽(Nisin)是目前食品保鮮中應用最廣泛的抗菌肽[6]。

人汗腺抗菌素DCD-1L是一種來源于人體皮膚的抗菌肽，穩定性好，在汗液中至少能抵抗蛋白水解長達40 h。DCD-1L是德國科學家Shcittek等[7]2001年從人體汗液中分離得到的小分子陰離子抗菌肽，具有廣泛應用前景。比如，DCD-1L有很好的抗菌活性，它能夠抑制多種病原微生物，對抗包括金黃色葡萄球菌、糞大腸桿菌、大腸埃希菌、惡臭假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等在內的細菌表現出較強的抗菌活性[8-9]。目前，獲得DCD-1L的方式包括：從人汗液中直接分離、化學合成和基因重組表達等[10]。DCD-1L在人體汗腺中濃度為1～10 μg/mL，從人汗液分離DCD-1L是一個非常煩瑣的過程，而且分離的量有限[11]，而化學合成DCD-1L成本太高。通過基因重組表達技術分離純化抗菌肽是目前廣泛采用的方法，大腸桿菌表達系統可以有效改善真核表達系統如哺乳動物細胞和轉基因小鼠成本高、周期長，產業化困難的現狀[12-13]。DCD全長110個氨基酸殘基，成熟的DCD-1L是位置在63～110的48個氨基酸，分子量4.8 kDa[14]。許多學者分別利用畢赤酵母表達和大腸桿菌系統進行DCD-1L的誘導表達，其中畢赤酵母表達量過低無法進行后續研究[15-16]。賴玉平[16]利用大腸桿菌表達系統，以融合蛋白形式進行誘導表達DCD-1L，但是表達后還需要蛋白酶酶切釋放DCD-1L。目前的報道主要集中在重組質粒的構建[17-19]，關于后期純化的報道相對較少：如Cipáková在大腸桿菌中以包涵體的形式表達一種含有C-末端高絲氨酸內酯的DCD-1L-1Hsl，再利用溴化氰CNBr水解法裂解融合蛋白蛋氨酸的C末端，但其裂解效率較低，并不適合大規模生產[20]。在另一項研究中，利用IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系統在大腸桿菌中表達重組融合蛋白DCD-1L，再通過幾丁質親和層析純化[21]。IMPACT系統完全避免了蛋白酶的使用，可以有效降低成本。但是，intein需要在較低的溫度和還原條件下才發生自身介導的N端裂解，從而釋放出與之相連的目的蛋白，然而還原劑的存在會破壞/影響蛋白的二級結構[22]。Ushanandin等[9]利用SUMO融合系統高效表達可溶性重組DCD-1L，后續還要利用Ulp1蛋白酶切除SUMO標簽，而Ulp1蛋白酶對酶解溫度和pH有較高的要求[23]，對DCD-1L的后續純化提出更高的要求。

本文在先前研究的基礎上，擬通過基因工程技術，將優化的DCD-1L基因片段克隆到pET28a + 載體上，以His組氨酸為標簽，轉化大腸桿菌表達菌株，將確定可誘導表達DCD-1L的菌株，經過大規模發酵、分離和純化，獲得高純度的DCD-1L，并初步對其抗菌活性進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌Escherichia coliDH5α、Escherichia coliBL21 (DE3)、Escherichia coliER2566、質粒pET28a+ 均由本實驗室保存；限制性內切酶 New England Biolabs公司；膠回收試劑盒 Promega公司；質粒小提試劑盒 天根生化科技有限公司；SDSPAGE電泳凝膠試劑盒、高保真PCR聚合酶 天津強微特生物科技有限公司；實驗所用純化填料 均來自美國GE healthcare；其他試劑 為國產分析純。

超濾管超濾離心管 美國Millipore公司；AKTApurifier TM100純化系統 美國GE healthcare；SCIE10TI-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司；垂直電泳儀 美國 Bio-Rad公司；凝膠成像系統 美國UVP公司；液體發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；單四極桿質譜儀(LC-MSD) 美國安捷倫公司；UV3100紫外可見光分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人源DCD-1L的基因克隆及載體構建 根據NCBI上人源DCD -1L基因編碼的堿基序列信息(Gene ID：117159)，確定目的基因序列如下：5，-CATATGAGTAGTCTGCTGGAAAAAGGCCTGG ATGGCGCAAAAAAGGCAGTTGGCGGCCTGGG CAAACTGGGTAAAGATGCCGTTGAAGATCTG GAAAGTGTGGGTAAAGGCGCCGTGCATGATG TGAAAGATGTGCTGGATAGCGTTCTGTAACAT ATG-3，其氨基酸組成序列為：SSLLEKGLDGA KKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHD VKDVLDSVL，確定本實驗的目的克隆序列。

經密碼子優化后合成目的基因片段由通用生物公司合成，通過無縫連接技術將目的片段插入到pET28a+上，得到質粒pET28a-DCD-1L。將構建好的質粒用限制性內切酶NdeI酶切驗證，配制50 μL反應體系(5 μL的NEBuffer，1 μL NdeI酶)，在37 ℃條件下反應1 h，將所得酶切產物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。將經過驗證的質粒分別轉化E. coliBL21(DE3)和E. coliER2566感受態細胞，用Kan抗性平板進行轉化子篩選，將篩選得到的正確克隆菌株，加入甘油，進行-80℃保藏，用于后續研究。

1.2.2 DCD-1L的誘導表達及條件優化 將-80 ℃保藏的重組表達菌株BL21 (DE3)-pET28a-DCD-1L和ER2566-pET28a-DCD-1L復蘇后，接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素(Kan)的LB培養基中，37 ℃，100 r/min振蕩過夜活化。將活化的BL21(DE3)-pET28a-DCD-1L和ER2566-pET28a-DCD-1L繼 續擴大培養接種于100 mL含有Kan的LB液體培養基中。當菌液A600達0.5～0.7時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1～1 mmol/L進行誘導表達。經條件優化后，確定誘導劑IPTG的添加量為0.5 mmol/L，16 ℃誘導過夜，菌體經6000 × g，10 min離心收集，利用超聲破碎儀破碎大腸桿菌細胞(超聲功率180 W，超聲2 s，暫停2 s，總超聲時間為5 min)，離心得到菌液上清和沉淀，再用50 mmol/L Tris-HCl將沉淀復溶，進行SDS-PAGE分析，配制12%分離膠和5%濃縮膠，恒定功率10 W，當條帶遷移距底端1～2 cm處停止電泳[24]。

由于DCD-1L分子量較小，常規的考馬斯亮藍染色無法觀察到目的條帶，因此電泳結束后選用更加靈敏的硝酸銀染色，操作順序如下：采用30%乙醇，10%乙酸固定至少30 min，用20%乙醇漂洗2次，0.8 mmol/L硫代硫酸鈉中浸泡1 min敏感化、雙蒸水漂洗2次、用12 mmol/L硝酸銀溶液浸漬銀染持續20～120 min，準備水和顯影溶液，按照銀染-水-顯影液的順序將凝膠從銀染液中取出，放入水中漂洗10 s，再從水中取出放入顯影液中，輕輕晃動，繼續顯色至條帶清晰，取出放入終止液中至少30 min終止反應，用雙蒸水漂洗兩遍，每次30 min[25]。

1.2.3 重組表達菌株ER2566-pET28a-DCD-1L發酵條件的研究 取保存于-80 ℃冰箱的菌種，按照1%添加量接于含Kan抗性的600 mL LB培養基中作為種子液，37 ℃，200 r/min，搖床培養過夜。次日，按照8%的接種量將種子培養基接入發酵罐中，設定溫度和轉速同種子液培養，用氨水調節pH，當A600=7.8時，加入7 mL 0.5 mmol/L的IPTG進行誘導，誘導3 h后進行SDS-PAGE。

1.2.3.1 發酵溫度對目標蛋白DCD-1L表達量的影響 利用發酵罐對重組表達菌株ER2566-pET28a-DCD-1L進行發酵，由于體系變大，獲得目的蛋白的最佳溫度不一定同搖瓶發酵條件一致，因此在10 L發酵罐中，分別控制溫度為27、32、37及42 ℃進行發酵，研究溫度對目標蛋白DCD-1L表達量的影響。每隔6 h取樣跑膠進行SDS-PAGE，用Image J軟件分析電泳條帶灰度，計算目的蛋白條帶所占百分比從而確定目標蛋白DCD-1L表達情況。

1.2.3.2 攪拌轉速對目標蛋白DCD-1L表達量的影響 采用優化發酵溫度，分別控制攪拌轉速為250、300、350和400 r/min進行攪拌，研究攪拌轉速對目標蛋白DCD-1L表達量的影響。

1.2.3.3 補料速度對目標蛋白DCD-1L表達量的影響 采用優化發酵溫度及攪拌轉速，當A600=1.0時開始補充高濃度0.125 g/mL胰蛋白胨、0.125 g/mL酵母粉和0.25 g/mL葡萄糖，兩種溶液分別高溫滅菌后，接種前混合均勻后連接到發酵罐，開啟蠕動泵分別以30、50、70和90 mL/30 min補料速度自動加入發酵罐中，確定補料速度對目標蛋白DCD-1L表達量的影響。

1.2.4 重組DCD-1L的純化 將發酵液離心后收集菌體(14000 r/min，25 min，4 ℃)，用50 mmol/L Tris-HCl, pH8.0，1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl，0.1 mmol/L PMSF，按照質量比1∶20重懸分散菌體，高壓均質破菌均質3次壓力分別為(300、850和950 bar)離心后收集上清液(14000 r/min，25 min，4 ℃)，過0.45 μm濾膜，獲得上清液，用于純化。

1.2.4.1 細胞破碎上清液超濾 取300 mL上述過濾后的上清液，利用Millipore Amicon? Ultra-15 10 K離心過濾器，離心條件為4000 r/min，20 min，4 ℃，取濾出部分。

1.2.4.2 細胞破碎上清液Q柱洗脫 分別配制緩沖溶液Q-A：pH9.0，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，緩沖溶液Q-B：pH9.0，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl。取150 mL破菌上清10 kDa超濾濾出液，以HiTrapQ HP預裝柱進行層析純化。以流速2.5 mL/min，0～50% Buffer B(20 mmol/L Tris-HCl，pH9.0，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl)進行洗脫，收集各步驟樣品，進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.4.3 細胞破碎上清液分子篩 配制pH6.5，10 mmol/L PB，0.1 mol/L NaCl，將Q柱洗脫目的組分經過HiPrep 26/60 Scphacryl S100柱層析，收集各步驟樣品，進行SDS-PAGE電泳檢測并分析蛋白純度和計算回收率。以上各步純化所得蛋白樣品均進行SDS-PAGE檢測，對檢測結果分別用Image J軟件進行條帶灰度分析，計算出目的蛋白條帶所占每步總蛋白條帶的百分比，即為目的蛋白的純度?；厥章实挠嬎闶抢肂radford法計算出高壓均質后的蛋白總濃度，乘以目的蛋白的純度即為初始目的蛋白總濃度CTotal，超濾、Q柱、S100柱純化后的目的蛋白濃度測定方法相同，并分別以CU、CQ和CS表示，相應得到的樣品體積為VU、VQ、VS，則各步驟純化后的回收率為：

1.2.5 重組DCD-1L蛋白質譜分析鑒定 將上述洗脫后收集的目的峰進行單四極質譜儀(液相色譜配套6120B)分析，試驗參數為：0 min 70%的水和30%的乙腈，以流量為0.3 mL/min梯度洗脫10 min后，變為30%的水、70%的乙腈，質譜掃描范圍是115～500，進樣量5 μL使用MSD控制，常規調譜文件atunes.tun離子源為API-ES，縫寬0.100 min，循環時間1.69 s/cycle。

1.2.6 DCD -1L抗菌活性檢測 本試驗選取陰性對照(pET28a+空載質粒破菌后上清)、陽性對照(1 mg/mL氨芐霉素)、pET28a-DCD-1L破菌的上清液和純化得到的DCD-1L蛋白，分別考察其對表皮葡萄球菌ATCC12228(革蘭氏陽性菌)和大腸桿菌DH 5α(革蘭氏陰性菌)生長的影響。將表皮葡萄球菌ATCC12228，大腸桿菌DH 5α進行復蘇，細菌在營養肉湯培養基中生長至對數中期，將兩種指示菌分別涂布營養肉湯(NB)固體培養基，分別在平皿上放置牛津杯，用移液槍吸取等量的樣液滴至牛津杯中，將平板置于37 ℃過夜培養，觀察結果。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復3次，采用SPSS 22.0軟件進行數據顯著性分析，應用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 人源DCD-1L基因的克隆與載體構建和表達

如圖1所示，構建好的質粒經NdeI單酶切后，由1%瓊脂糖凝膠結果可知，目標條帶大小為5000～7500 bp，復合預期大小5369 bp，將構建好質粒分別轉化至不同感受態細胞，誘導后檢測目標蛋白DCD-1L表達情況。

圖1 質粒pET28a-DCD-1L經NdeI單酶切鑒定圖Fig.1 Identification of the cloning expression vector by NdeI enzyme digestion

如圖2所示，將構建好的pET28a-DCD-1L質粒轉化至BL21(DE3)感受態細胞，接種培養后，經過IPTG誘導后，目標蛋白DCD-1L并沒有實現表達，誘導前后在低于14.4 kDa沒有條帶變化。而轉化至ER2566感受態細胞可實現目標蛋白的可溶表達(見圖中紅色虛框)。感受態細胞BL21(DE3)和ER2566均來源于BL21，可用于T7啟動子表達載體(如pET系列)的高水平蛋白表達[26]，但二者主要區別在于ER2566為Lon和ompT蛋白酶缺陷菌株。Lon蛋白酶和膜外蛋白酶ompT的缺失能夠有效抑制異源蛋白在大腸桿菌體內的降解，提高外源DNA的轉化效率[27]。

圖2 SDS -PAGE檢測不同大腸桿菌菌株對DCD-1L的誘導表達Fig.2 SDS-PAGE analysis expression of recombinant DCD-1L in different competent cell

2.2 重組菌ER2566-pET28a-DCD-1L發酵條件優化

大腸桿菌在不同的發酵條件下，如溫度、轉速和補料速度等培養條件下，目標蛋白的產量也會有很大的差異。因此，為進一步研究重組大腸桿菌ER2566-pET28a-DCD-1L的發酵特性，以提高DCD-1L的產量，縮短發酵周期，同時降低發酵成本，對重組菌株ER2566-pET28a-DCD-1L的培養條件進行優化。

由圖3A可知，隨著發酵溫度的提高細胞干重和DCD-1L含量逐漸增加，并在37 ℃達到最高值，42 ℃時細胞干重和DCD-1L含量下降。溫度是發酵生產的重要參數直接影響細胞內各種酶活性[28]。發酵溫度升高酶反應速率提高，可有效縮短發酵周期。超過最適溫度會導致大腸桿菌細胞內酶失活，菌體容易衰老，影響目的蛋白DCD-1L最終產量。

圖3 重組菌ER2566-pET28a-DCD-1L發酵條件的研究Fig.3 Study on fermentation conditions of recombinant strain ER2566-pEt28a-DCD-1L

由圖3B可知，攪拌轉速對細胞干重和DCD-1L產量具有明顯影響，隨著轉速提高細胞干重和DCD-1L含量逐漸增加。轉速影響培養基中的溶氧量，發酵過程中營養物質的充分混勻提高菌體對營養物質的利用率；另一方面過高的轉速產生的剪切力會對菌體產生影響[29]。本實驗選用較低的轉速(不大于400 r/min)，由結果可知攪拌速度在400 r/min并沒有抑制細胞生長。

由圖3C可知，隨著補料速度提高，細胞干重和DCD-1L產量先增加后降低，過高的補料速度并不利于菌體生長，主要原因是快速增長的菌體會消耗大量氧氣，使得發酵罐體溶氧量迅速下降反而不利于菌體生長[30]。

通過單因素實驗，對不同溫度、不同轉速、不同補料速度等發酵條件進行了研究與優化，確定重組大腸桿菌ER2566-pET28a-DCD-1L發酵生產DCD-1L的最適條件為：接種量為8%，37 ℃，400 r/min，開啟蠕動泵以50 mL/30 min補料速度自動加入發酵罐中，進行培養發酵。

2.3 重組DCD-1L的分離純化

2.3.1 細胞破碎上清液超濾 發酵液離心后收集菌體，菌體經過超高壓均質破碎后離心收集上清液，將上清液移入10 kDa超濾管，在4000×g、4 ℃條件下離心超濾20 min，收集流穿，將離心超濾前后的樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果如圖4所示：空色虛框內為目的蛋白，超濾已去除大量雜質蛋白，但還有部分殘留。根據DCD-1L蛋白氨基酸組成，在expasy網站上預測其蛋白等電點為5.07(https://web.expasy.org/protparam/#opennewwindow)，隨后利用強堿性陰離子交換樹脂(Q柱)進行柱層析。

圖4 超濾前后重組蛋白DCD-1L對比情況Fig.4 Comparison of recombinant protein DCD-1L before and after ultrafiltration

2.3.2 超濾后上清液Q柱洗脫 將上述超濾后得到的樣品Q柱上樣，梯度洗脫10 min后，用50%～100% Buffer B(20 mmol/L Tris-HCl，pH9.0，1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl)繼續洗脫2 min，結果如圖5所示，在洗脫體積為200～230 mL(約0.4 mol/L NaCl)洗出2個峰，230～250 mL(約0.7 mol/L NaCl)洗出1個峰，后對洗脫結果進行SDS-PAGE，確定先洗脫出來的兩個峰為雜峰，最后洗脫出來的為目的峰(紅色虛框標出的為目的蛋白)，由電泳圖可知還有部分雜質蛋白的存在，根據分子量大小區別，后續利用分子篩進行層析分離。

圖5 重組蛋白DCD-1L Q柱離子交換層析純化曲線Fig.5 Q anion exchange chromatography purification curves of recombinant DCD-1L

2.3.3 Q柱洗脫后分子篩層析 收集Q柱洗脫下來的目的峰，上樣S100分子篩，經過10 mmol/L PB溶液，pH6.5，0.1 mol/L NaCl洗脫，如圖6所示獲得一個非對稱峰，就該峰不同部位分別收集跑SDSPAGE確定，峰尾部分為單一目的條帶。

經高壓均質獲得的細胞上清液，依次經過超濾、Q柱、分子篩，最終獲得一條低于14.4 kDa之間的條帶(如圖6)，而預期重組蛋白大小為4.8 kDa，在14.4 kDa Marker下方。重組人DCD-1L蛋白純化工藝各步驟回收率如表1所示，純化回收得到的產品純度96%以上，總回收率為18.4%。為確定其準確分子量大小，后續進行質譜檢測。

圖6 重組蛋白DCD-1L 分子篩S100純化曲線Fig.6 S100 purification curves of recombinant DCD-1L

表1 重組人DCD-1L蛋白純化工藝各步驟回收率Table 1 Recovery rate of each step of the purification process of recombinant human DCD-1L

2.4 DCD-1L蛋白質譜分析鑒定

如圖7所示，收集從分子篩S100洗脫下來的峰尾1和峰尾2，富集后用單四極桿液質聯用系統，通過分子量信息快速鑒定化合物。由液相色譜圖可知，在2.792 min有一個極強吸收峰，后利用質譜數據分子離子峰的相對強度，對于C，H，N，O組成的化合物，其通式為：CXHYNZOW，RI(M+1)/RI(M)*100=1.1x+0.37z和RI(M+2)/RI(M)*100=(1.1x)2/200+0.2w[31]，目標化合物檢測預期最大分子量為4862 Da，與目的蛋白4.8 kDa，大小一致，表明該蛋白為重組DCD-1L蛋白。

圖7 重組蛋白DCD-1L LC-MS圖Fig.7 LC-MS map of recombinant DCD-1L

2.5 DCD-1L活性定性檢測

DCD-1L是從人體汗液中分離出來的一種天然活性多肽，在較廣的pH范圍和高鹽濃度下都具有抗部分細菌和真菌的活性[32]。由圖8可知，DCD-1L對大腸桿菌和表皮葡萄球菌均有抑菌作用，對表皮葡萄球菌抑菌活性更高。

圖8 DCD-1L對表皮葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)的抗菌活性Fig.8 activities of DCD-1L anti Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli

3 結論

盡管在2001年研究人員就已經發現DCD-1L的抗菌特性，但在文獻中只有很少的構建純化系統被報道。為數不多的生產和純化DCD-1L的方法均是基于融合蛋白的方式。本研究所構建的重組菌可實現人源DCD-1L的異源可溶表達，通過建立穩定的純化工藝，直接得到無需酶切的DCD-1L，最終得到的重組DCD-1L純度大于96%，可用于后期大量生產。本研究目前的一個局限性是缺乏對其他細菌和真菌抑菌活性的數據。因此，DCD-1L對鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌等病原菌的抑菌活性有待進一步研究。接下來將進一步研究對不同細菌的抗菌活性、最小抑菌濃度以及及抑菌機理。本實驗建立的DCD-1L異源表達體系更為簡便，為其進一步的理論和工業應用研究奠定了基礎。