蘋果渣飼料中展青霉素生物脫除的條件優化及脫除前后飼料中營養物質評價

楊 陽，鄒 東，紀 劍，王海鳴，張銀志，朱 璇 ，孫秀蘭,

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；3.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東廣州 510000)

展青霉素(Patulin，PAT)又稱棒曲霉毒素，分子式C7H6O4(如圖1)，是一種有毒的真菌次級代謝產物[1]，對人和動物有多種毒性[2-3]。研究表明展青霉素對大鼠和小鼠具有致癌、致畸、免疫毒性、基因毒性和神經毒性等作用，可導致肝臟，脾臟和腎臟等損傷，嚴重威脅人和動物的健康[4-7]。鑒于展青霉素的毒性危害，世界上多個國家都制定了限定標準，我國規定蘋果汁和蘋果制品中展青霉素的最高含量不得超過50 μg/kg[8]；歐盟限定果汁產品中展青霉素的含量最高不得超過50 μg/kg，固體水果產品中最高不得超過25 μg/kg，兒童和嬰兒食品中不得超過10 μg/kg[9]；世界衛生組織建議，人類每天攝入的展青霉素量不應超過0.4 μg/kg[10]。因此，研究展青霉素的脫毒十分有必要。目前，展青霉素的脫毒方法主要為物理[11-12]、化學[13]和生物方法[14]。物理方法主要采用對原料的挑選清洗、微波處理和吸附雜質等方式[15]，該方法需要耗費大量的人力物力，成本較高，且容易造成原料中營養成分損失；化學方法主要為使用添加劑或化學殺菌劑等手段降低展青霉素的含量[16]，但該方法會破壞產品的品質，造成農藥殘留等二次污染問題；生物發酵法與這些方法相比具有經濟、高效等特點，越來越吸引研究者的關注[17-18]。

圖1 展青霉素的化學結構圖Fig.1 Chemical structure diagram of patulin

我國是世界最大的蘋果生產國，2018年蘋果總產量達到3923.34 噸[19]。近年來隨著蘋果產量的增加，我國蘋果濃縮汁加工業也得到了迅速的發展，在蘋果汁的生產過程中會產生大量的蘋果渣，每年我國有超過300萬噸蘋果渣產生[20]，這些蘋果渣處理不當，不僅會造成資源浪費，還會造成環境污染。蘋果渣中纖維素含量較高而蛋白質含量較低，若將其直接作為動物飼料，容易帶來動物的營養不良、腹瀉等問題[21-22]。蘋果渣含有較高的水分，極易被微生物侵染。擴展青霉是蘋果及其制品的主要污染微生物，其污染會產生大量展青霉素[23]。目前我國并未對飼料原料中的展青霉素做出明確的限量標準，大多養殖場在使用蘋果渣做為飼料時并未對其真菌毒素進行檢測，這為蘋果渣的資源化應用帶來了很大的風險。

目前，利用微生物發酵蘋果渣的研究在國內外已有一些報道[24]，大多數研究是為了改善蘋果渣中的蛋白質含量，使其更適用于動物飼料[25]。關于微生物發酵法脫除蘋果渣中展青霉素污染的研究未見報道。發酵菌株黑曲霉FS10是本課題組從發酵醬油醅中篩選而得[26]，已被證明是食品級安全菌株，在過去的研究中該菌株顯示出對多種真菌毒素優異的降解能力[27-28]。本研究使用黑曲霉FS10菌株生物發酵展青霉素污染的蘋果渣，采用響應面法對比不同條件下發酵前后展青霉素的降解率變化，篩選出最優的發酵參數，并對最佳發酵參數下蘋果渣中營養物質進行評價。該研究目的旨在為蘋果渣資源化利用的提供新思路，并為研發一種安全富有營養的蘋果渣飼料提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 本課題篩選并保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC M2013703；展青霉素污染的蘋果渣(烘干) 隨機采購于江蘇省十家養殖場，經檢測所采購樣品均存在較高的展青霉素污染(2.61～11.37 mg/kg)，選取污染最嚴重的樣品進行后續實驗；展青霉素標準品 純度≥98%，美國GLPBIO公司；乙腈、乙酸乙酯 色譜純，上海國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基) 上海博微生物科技有限公司。

Agilent 1260 HPLC 系統 美國安捷倫公司；VB-40立式高溫高壓滅菌鍋 德國SYSTEC；BSC-1300超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；SHP-150生化培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱、SX2-5-12N馬弗爐 上海一恒科學儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀、SOX406脂肪測定儀 山東海能科學儀器有限公司；THZ-D臺式恒溫振蕩器 上海百典儀器設備有限公司；EX-OHOUS電子天平、旋渦振蕩儀 美國奧豪斯公司；Scientz-10N臺式冷凍干燥機、Scientz-10LS真空離心濃縮儀、SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Eppendorf離心機 德國艾本德公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑曲霉FS10菌株活化及孢子懸浮液制備 將黑曲霉FS10接種于PDA固體培養基28 oC培養5 d后用含0.05%吐溫-80的無菌生理鹽水將孢子洗下，調整孢子濃度為106CFU/mL，作為FS10孢子懸液備用。

1.2.2 蘋果渣生物發酵處理 將蘋果渣粉碎，過30目篩后混合均勻收集蘋果渣備用。利用GB/T 14699.1-2005的采樣方法對粉碎后蘋果渣進行采樣稱重后分裝于50 mL三角錐形瓶中，使用封口膜封口，進行121 ℃、20 min滅菌處理。

將滅菌處理過的蘋果轉移至發酵容器中，加入無菌水至一定料水比(蘋果渣質量與無菌水體積的比值，g/mL)，加入FS10孢子懸浮液至一定接種量(菌液體積與蘋果渣質量的百分比)，攪拌均勻后于一定溫度下進行恒溫有氧發酵，分別在發酵后一定時間取樣。

1.2.3 蘋果渣中展青霉素及營養指標含量的測定 參考GB5009.185-2016對蘋果渣中展青霉素進行提取和濃度測定；參考GB/T 6432-2018對蘋果渣中粗蛋白進行檢測；參考GB/T 6434-2006對蘋果渣中粗纖維素進行檢測；參考GB/T 6433-2006對蘋果渣中粗脂肪進行檢測；參考GB/T 18246-2019對蘋果渣中氨基酸進行檢測；參考GB/T 6438-2007對蘋果渣中灰分物質進行測定。

1.2.4 單因素實驗設計 以展青霉素脫除率為指標，控制孢子懸浮液濃度為106CFU/mL，分別對接種量1%、5%、10%、15%、20%，料水比 1∶3(g/mL)，培養溫度30 oC，發酵時間3 d；發酵溫度20、25、30、35、40 oC，料水比 1∶3，接種量 10 %，發酵時間3 d；發酵時間1、2、3、4、5 d，料水比1∶3(g/mL)，接種量10%，培養溫度30 oC；料水比1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4 g/mL，接種量10%，培養溫度30 ℃，發酵時間4 d。分別對4個因素進行單因素實驗，確定各因素對展青霉素降解效率的影響。

展青霉素降解率計算方法為：展青霉素降解率(%)=(未發酵樣品中展青霉素含量 - 發酵后樣品中展青霉素含量)/未發酵樣品中展青霉素含量 × 100

1.2.5 響應面法因素水平設計 根據單因素實驗結果，利用Design Expert11軟件應用Box-Behnken設計方法，選擇接種量(A)、發酵溫度(B)、發酵時間(C)、料水比(D)作為響應變量，以展青霉素降解率作為響應值進行響應面優化設計，試驗因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3 數據統計分析

所有實驗均重復3次，采用SPSS 26、GraphPad Prism 8、Design Expert 11軟件對數據進行處理分析及圖像繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 接種量對展青霉素脫除的影響 不同接種量對于黑曲霉脫除蘋果渣中的展青霉素有著重要影響，接種量過小或過大均不利于發酵的進行。圖2表示不同接種量對展青霉素降解率的影響，在接種量為10%時，展青霉素的降解率最高，在接種量為1%～10%時展青霉素降解率隨著接種量增加而升高，接種量為15%時，展青霉素降解率明顯下降，這可能是發酵體系中的營養物質有限，接種量過大造成微生物之間生存競爭加大，從而導致微生物的生長受到抑制，所以選擇10%的接種量最為適宜。

圖2 接種量對黑曲霉脫除展青霉素的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.1.2 發酵溫度對展青霉素脫除的影響 不同發酵溫度會對發酵微生物生理活性產生極大的影響，且對同一發酵微生物而言，菌最適生長溫度與最適發酵的溫度并不一定相同，故需要對黑曲霉降解蘋果渣中展青霉素的最適發酵溫度進行探究。由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，蘋果渣中展青霉素的降解速率呈現先升高后降低的趨勢。當溫度為30 ℃時展青霉素降解率達到最高，當溫度達到40 ℃時，降解率迅速降低。這可能是由于每種微生物都有比較適合生長和發酵的溫度，溫度過低微生物的生長繁殖變慢，而溫度過高會導致微生物內的酶活降低，影響其正常的生長，因此選擇30 ℃的發酵溫度最為適宜。

圖3 發酵溫度對黑曲霉脫除展青霉素的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.1.3 發酵時間對展青霉素脫除的影響 發酵時間是發酵過程中的重要參數之一，由圖4可得，展青霉素降解率隨時間的延長而升高，在發酵時間為3～5 d后基本保持穩定。參考劉倩男[29]研究，發酵蘋果渣多用于動物飼料使用，需要發酵過程豐富其中蛋白含量，且發酵時間過長黑曲霉會產生大量的黑色菌絲，影響發酵物的感官品質。因此本研究選擇發酵時間4 d為最佳發酵時間。

圖4 發酵時間對黑曲霉脫除展青霉素的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.1.4 料水比對展青霉素脫除的影響 發酵體系中的水分含量在微生物發酵過程中起著至關重要的作用，如圖5可知，隨著料水比的增大，蘋果渣中展青霉素的降解率呈先升高后穩定的趨勢，水分含量較低時微生物的活性較弱，隨著水分含量的增加微生物的生理活性也隨之增加，當水分含量滿足微生物需求時，其對微生物的生長影響不大。當料水比為1∶3時展青霉素降解率達到最大值，故選取1∶3作為蘋果渣中展青霉素的最適發酵料水比。

圖5 料水比對黑曲霉脫除展青霉素的影響Fig.5 Effect of ratio of material to water on the removal of patulin by Aspergillus niger

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計因素與水平 為了得到黑曲霉發酵脫除蘋果渣中展青霉素的最適參數，根據上述單因素實驗得到的較優發酵參數，采用響應面法對接種量、料水比、發酵時間、發酵溫度四個因素兩兩交互影響進行響應面試驗設計。通過單因素實驗確定黑曲霉生物發酵脫除蘋果渣中展青霉素的四個單因素參數適宜范圍，選取展青霉素降解率為考察指標進行響應面優化。結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results

2.2.2 響應面回歸模型的建立與分析 通過Design Expert 11對實驗結果進行回歸擬合及方差分析，得到以展青霉素降解率(Y)為響應值，接種量(A)、發酵溫度(B)、發酵時間(C)、料水比(D)的二次多項回歸模型：

為檢驗回歸模型的有效性，對回歸模型進行方差和顯著性分析，見表3。

結果表明，回歸模型極顯著(P<0.001)，失擬項不顯著(P>0.05)，R2adj為0.8459，表明該模型有較好的擬合性，該回歸模型可用于預測分析且能較好地反映各因素與響應值之間的關系。由表3可知，蘋果渣中展青霉素降解率的影響因素主次順序為發酵溫度>料水比>發酵時間>接種量。

表3 展青霉素降解率回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of patulin degradation rate regression model

2.2.3 各因素兩兩交互作用 如圖6所示，影響黑曲霉發酵蘋果渣的4個因素(接種量、發酵溫度、發酵時間和料水比)兩兩因素交互作用的響應面圖，結合表3結果，交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD對試驗結果的顯著性分析均為P>0.05，表明接種量、發酵溫度、發酵時間和料水比這4 個因素的兩兩交互作用不顯著。上述回歸模型的最佳值存在響應面最高點，等高線圖的圓心，即展青霉素降解率最大時的穩定點，與之對應的因素水平即為最佳工藝條件[30]。

2.2.4 響應面最優條件的確定 運用Design Expert 11 軟件分析得最優脫除展青霉素的參數為接種量9.54%，發酵溫度31.25 oC，發酵時間3.91 d，料水比1∶3.24。此條件下預測的展青霉素降解率為98.33%。鑒于實際實驗操作的可行性，選取接種量10%，發酵溫度31 oC，發酵時間4 d，料水比1∶3.2，在此條件下進行黑曲霉生物發酵蘋果渣實驗，設置3個平行，得到展青霉素均降解至檢出限以下(6 μg/kg)，降解率為100%，與理論值相對誤差為1.67%，說明該優化參數可行，具有實際應用價值。

2.3 最優發酵參數下蘋果渣中營養物質評價

在展青霉素降解的最佳條件下，對發酵前后蘋果渣中粗蛋白、粗脂肪等營養物質進行研究。以干物質為基礎，與發酵前蘋果渣相比，發酵后的蘋果渣中粗纖維含量從20.26%降低17.32%；粗蛋白含量從 8.16% 提高至 10.08%；粗脂肪含量從3.32%提高至4.06%；粗灰分從3.34%提高至4.76%；總氨基酸含量從發酵前的64.43 mg/g提高至73.78 mg/g(表4、表5)。表明黑曲霉FS10可以利用蘋果渣中殘余的營養物質，降解蘋果渣中的纖維素并合成蛋白質，同時氨基酸含量也顯著提高。氨基酸能夠增強動物的免疫力，增進動物食欲，促進動物生長發育等作用。該方法不僅能對污染蘋果渣進行解毒脫毒，還能獲得微生物發酵過程中的氨基酸、蛋白質等中間代謝產物，符合發酵飼料的菌種篩選條件[31]，為污染蘋果渣的資源化利用提供了新的思路。

3 結論

本研究利用黑曲霉FS10生物發酵蘋果渣，研究了接種量、料水比、發酵時間、發酵溫度四個因素對蘋果渣中展青霉素降解效果的影響，運用響應面法優化上述四個條件對展青霉素的降解效果，研究結果表明在接種量10%，發酵溫度31 oC，發酵時間4 d，料水比1∶3.2的條件下進行黑曲霉生物發酵展青霉素污染的蘋果渣，通過對發酵條件的優化發現該黑曲霉菌株對展青霉素的脫除有著明顯的效果，可將其降解至檢出限以下(6 μg/kg)，即發酵后蘋果渣中的展青霉素完全被降解。

有研究表明黑曲霉發酵可用于開發蘋果渣蛋白飼料，減少動物直接使用蘋果渣飼料時造成的營養不良[29]。本研究對展青霉素降解最優條件下發酵后蘋果渣的基本物質進行測定。結果表明，發酵后的蘋果渣中粗纖維含量從20.26%降低17.32%；粗蛋白含量從 8.16% 提高至 10.08%；粗脂肪含量從3.32%提高至4.06%；粗灰分從3.34%提高至4.76%；總氨基酸含量從發酵前的64.43 mg/g提高至73.78 mg/g。因此，黑曲霉FS10發酵展青霉素污染的蘋果渣，不僅能完全脫除蘋果渣中的展青霉素，還能改善蘋果渣為原料的飼料中蛋白質、氨基酸等營養物質含量較低的問題，并為安全、富有營養的蘋果渣飼料加工提供了有力的技術參考。此外，進一步優化發酵條件，更好地提高發酵后蘋果渣中蛋白質、氨基酸等營養物質的含量，以及探究發酵蘋果渣飼料對動物生長發育的影響將是今后研究的重點。

圖6 各因素交互作用對展青霉素降解率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots of the interaction of various factors on the removal rate of patulin

表4 黑曲霉固態后發酵蘋果渣基本成分的變化(干物質基礎)Table 4 Effect of Aspergillus niger fermentation on nutrients composition of apple pomace( DM basis)

表5 黑曲霉固態發酵蘋果渣后氨基酸成分的變化(干物質)Table 5 Effect of Aspergillus niger fermentation on amino acid composition of apple pomace (DM basis)