非標記定量蛋白質組學研究干燥方式對牡丹花差異蛋白質的影響

許 寧，趙悅菡，侯召華,,

(1.山東省農業機械科學研究院, 山東濟南 250000；2.齊魯工業大學（山東省科學院）食品科學與工程學院, 山東濟南 250353)

牡丹是我國十大傳統名花之一，為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect. Moutan DC)的多年生落葉灌木，原產于我國，世界各地廣泛種植的牡丹品種均起源于中國[1]。牡丹富含多酚、黃酮、萜類、芳香烴類等多種生物活性成分，具有抗氧化、抗菌消炎、抗腫瘤，治療糖尿病、腎病、動脈粥樣硬化等作用[2]。牡丹花茶是近年來深受大眾喜愛的花茶飲品之一，需求量顯著增加，但在牡丹花茶制作加工中存在變色、茶色感官接受度低、干制后花香難以保留等問題[3]，這嚴重影響了牡丹花茶的價值。

目前，牡丹花干燥方式主要為自然干燥、干燥箱熱風干燥、真空冷凍干燥、微波干燥等。目前工業生產主要以熱風干燥為主，熱風干燥的媒介是空氣，富含氧氣，容易發生酶促褐變和氧化，引起質量變化，但是該方法成本分，易于實現，應用最為廣泛。自然干燥容易受環境條件影響，產品容易皺縮，色澤暗淡，且干燥時間長[3]。真空冷凍干燥是一種新型干燥技術，應用在牡丹花干花的制備上，能很好地保證牡丹花原有的色澤、形狀及產品復水性[4-5]，但該方法干燥后花瓣非常脆，容易折斷和破碎。目前，不同加工方式對牡丹花干燥的研究，多種在色澤及花色苷黃酮類物質含量變化，加工過程中機理變化研究較少。

蛋白質組學主要研究蛋白質結構、表達水平、蛋白質之間的相互作用及翻譯后的修飾等。利用蛋白質組學可探索蛋白質的調控規律，從而更加全面地掌握生命現象和本質，了解生命活動的規律[6]。基于質譜檢測技術的蛋白質組學定量技術有兩種：標記定量技術(Labeling quantitation)和非標記定量技術(Label free quantitation)。非標記定量技術指不對樣本進行標記，樣本酶解產物分別進行質譜分析，然后根據峰面積或者肽段總次數對肽段和蛋白質進行相對定量。非標記定量蛋白質組學對液相色譜串聯質譜的穩定性和重復性要求較高；實驗耗費低，無需昂貴的同位素標簽做內部標準；對樣本的操作也最少，從而使其最接近原始狀態，并且不受樣品條件的限制，可以克服標記定量技術在對多個樣本進行定量方面的缺陷[7]。近年來，蛋白質組學技術越來越多應用于植物保鮮加工等領域，在蛋白質水平上探討加工作用機理。李新明等[8]采用Label free技術分析了蘋果片在干制條件下及復合護色劑處理后果肉中蛋白質組學的變化，為復合護色劑應用于果蔬護色提供科學依據。

本文利用非標記定量蛋白質組學技術對真空冷凍干燥、自然干燥和熱風干燥牡丹花進行蛋白質組學的差異性比較，研究不同干燥技術對牡丹花的作用機理，以期為牡丹花的干燥方式及應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹鳳牡丹 來源于山東聊城東阿魯油牡丹公司，2020年4月20日采摘于公司基地，2 h內進入實驗室處理；胰蛋白酶Sequencing grade modified trypsin V5111(14369 U/mg) 普洛麥格北京生物技術有限公司；三氯乙酸TCA、丙酮、二硫蘇糖醇DTT、碘乙酰胺Iodoacetamide、尿素Urea、碳酸氫銨NH4HCO3均為分析純，Sigma公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸(均為質譜級)，三氟乙酸TFA(色譜級) Thermo Fisher公司。

Ultimate 3000 RSLC Nano液相色譜儀、Q Exactive HF納升液相色譜-四極桿串聯靜電場軌道阱超高分辨質譜儀(QEHF，Orbitrap 240000FWHM) 美國賽默飛世爾科技有限公司；Allgera X-30R冷凍高速離心機 美國Beckman公司；BTP8ZL真空冷凍干燥器 美國SP Scientific公司；BILON-650Y超聲波細胞粉碎機 上海比朗儀器制造有限公司；MDF-U3386S超低溫冰箱 日本三洋；Milli-Q Reference超純水儀 密理博中國有限公司；GZX-150BS-III生化培養箱 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；賽多利斯Q-124cn電子天平 賽多利斯上海貿易有限公司；μ-Precolumn捕集柱(300 μm×5 mm,C18PepMap 100, 5 μm, 100 ?) Thermo Scientific；Acclaim PepMapTMRSLC 分析柱(75 μm×15 cm,nanoViper, C18, 2 μm, 100 ?) Thermo Scientific；10 kDa超濾離心管(10 kDa，0.5 mL) 密理博中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗流程

樣品處理及試驗流程如圖1所示。

圖1 樣品處理及試驗流程Fig.1 Workflow for sample preparation and experiment

1.2.2 牡丹花干燥

1.2.2.1 真空冷凍干燥(Freeze-drying，FD) 牡丹鮮花在超低溫冰箱-80 ℃下冷凍8 h以上，放入真空冷凍干燥器中，冷阱-103～-105 ℃，冷凍干燥24 h。干燥樣品粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2.2 熱風干燥(Hot-air drying，HD) 牡丹鮮花迅速放置在鼓風干燥箱中，溫度70 ℃，時間16～18 h。干燥樣品粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2.3 自然干燥(Natural drying，ZD) 牡丹鮮花放置在托盤上，直接晾曬，48 h。干燥樣品粉碎，過60目篩，備用。

1.2.3 蛋白質提取及分析 蛋白質提取及分析方法參考文獻[9-10]，略有改動。稱取3 g樣品粉末，放入50 mL離心管，加入5倍體積-20 ℃預冷丙酮(含體積分數為10%三氯乙酸TCA和0.07%β-巰基乙醇)；勻漿旋渦混勻后于-20 ℃放置4 h以上；10000×g，4 ℃，離心30 min，棄去上清液，得到蛋白質沉淀；沉淀用100%預冷丙酮5 mL，清洗3次，10000×g，4 ℃，離心15 min；待沉淀中丙酮氮氣吹干后，得到蛋白質粗提物。取約0.25 g蛋白質粗提物溶解在2.5 mL尿素裂解液(5 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，2% CHAPS, 2% SB-3-10，1% PMSF,20 mmol/L DTT)，超聲波破碎處理(50%功率，工作2 s，間歇3 s，循環5～10 min)；處理后，14000×g，20 ℃，離心40 min，得到上清液，過0.45 μm濾膜過濾，得到蛋白質溶液，考馬斯亮藍法定量分析，-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 蛋白質酶解 蛋白質樣品酶解采用超濾輔助樣品制備(Filter-aided sample preparation，FASP)[11-12]。取上述提取蛋白質樣品100 μg放入10 kDa超濾膜離心管中，14000×g，室溫下離心15 min；離心過后，超濾管中加入 0.1 mL 100 mmol/L DTT-50 mmol/L NH4HCO3溶液，在50 ℃生化培養箱中，保持30 min；14000×g，室溫下離心15 min；然后超濾管中加入100 μL 50 mmol/L iodoacetamide-UA buffer(8 mmol/L urea，150 mmol/L Tris‐HCl，pH8.0)溶液，30 ℃，避光保持40 min后，14000×g離心；接著用100 μL UA-buffer重復離心沖洗三次，每次14000×g，室溫離心15 min；然后用100 μL 50 mmol/L NH4HCO3沖洗，重復離心3次；然后取100 μL胰蛋白酶-50 mmol/L NH4HCO3溶 液(胰 蛋 白 酶∶蛋 白質=1∶25)，加入到超濾管中，37 ℃生化培養箱，過夜15 h；然后加入2 μL甲酸終止反應5 min。14000×g，20 ℃，離心40 min，得到離心液，用C18Cartridge肽段脫鹽，待QEHF檢測。

1.2.5 質譜分析 樣品分析根據Soares等[13]的方法，略有修改。利用Q Exactive HF納升液相色譜-四極桿串聯靜電場軌道阱超高分辨質譜儀(QEHF,Orbitrap 240000 FWHM)對酶解肽段混合物進行分析。多肽段載入捕集柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap 100，100 μm×2 cm, nanoViper C18)，然后進入C18分析柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap 100, 15 cm×75 μm, 3 μm)；納升液相，流動相A為0.1%甲酸溶液；B為80%乙腈0.1%甲酸溶液。流速 為300 nL/min；梯 度120 min；0～3 min，4%B；3～100 min，4%～34%B；100～115 min，34%～45%B；115～120 min，99%；

質譜采用離子源為陽離子模式；DDA模式數據采集；一級質譜參數：分辨率120000 FWHM，掃描范圍150～1800 m/z；動態排阻時間30 s；掃描次數20；二級質譜參數：分辨率15000 FWHM，掃描范圍150～1800 m/z；標準碰撞能27 eV。

1.2.6 質譜數據處理 質譜原始數據利用軟件Proteome Discoverer(PD, ver. 2.2, Thermo Scientific,Bremen, Germany)進行搜庫，目標蛋白質來自UniProtKB/Swiss-Protpaeonia database (release 2020_07, 394421 total entries, downloaded 07/18/20)。搜庫參數設置[14]：酶切特異性：賴氨酸精氨酸；酶切允許2個漏切位點；肽段>6個氨基酸長度；母離子質量精度：20 ppm；碎片離子精度20 ppm；半胱氨酸烷基化(C)為固定修飾；甲硫氨酸氧化(M)、乙酰化修飾、脫氨基為可變修飾；肽段和蛋白質FDR<0.01；Razor和unique peptides用于蛋白質定量。

1.2.7 統計學分析 使用Perseus軟件(版本號：1.6.5.0)對搜庫數據結果進行顯著分析、主成分分析(Principle Component Analysis，PCA)、層次聚類分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)[15]。蛋白質含量豐度進行數值轉化log2-transformed，Z-scores中心化，并且缺失值正態分布填充(width 0.3，downshift 1.8)；Benjamini-Hochberg FDR<0.01。

1.3 差異蛋白質（Differential Expression Proteins,DEPs）生物信息學分析

差異倍數Fold change(FC)≥2，P<0.05或FC≤0.5，P<0.05為差異蛋白質[16]。差異蛋白質的GO注釋富集分析、KEGG注釋富集分析、PPI通過在線分析軟件Omicsbean (http://www.omicsbean.cn)進行分析[17]，圖片利用cytoscape3.7.0 進行優化。

2 結果與分析

2.1 數據分析

2.1.1 蛋白質鑒定及定量結果 本研究共定性蛋白質1423個，定量1349個，占總數的94.80%。FD、HD、ZD定量蛋白質分別為1325、677、1085個，三組樣品共有定量蛋白質為656個(圖2)。

圖2 三種牡丹花瓣樣品中蛋白質韋恩圖Fig.2 Venn diagram of proteins in three different peony sample

2.1.2 主成分分析(PCA)和層析聚類(HCA)數據分析 用PCA法對9個樣本蛋白質做分析。數據中多元變量通過計算使其按照方差依次遞減的順序排列，得到的第一變量表示數據中最大的方差，稱為第一主成分(PC1)，第二主成分(PC2)表示方差次之，經過軟件計算得到得分圖(圖3)。熱圖(heatmap)可簡單聚合大量數據，將結果以一種漸進的色帶直觀地展現出來，可看出數據的疏密和頻率高低程度[18]。

由圖3得分圖可知，新生成的變量PC1、PC2能夠解釋說明數據96.5%的變化，9個樣本被顯著地分成3類，FD01、FD02、FD03歸于一類；ZD01、ZD02、ZD03歸于一類，HD01、HD02、HD03歸于一類，這表明相同干燥方式樣本歸為一類，加工方式對牡丹花蛋白質有顯著影響。同時凍干樣品與自然干燥又可以聚成一簇，表明兩組樣品蛋白質相似；這兩種干燥方法都屬于低溫干燥方式，可能溫度能顯著影響蛋白質組成及含量。

圖3 三組樣品中656個共有定量蛋白質主成分分析和層次聚類熱圖Fig.3 PCA score plot and heatmap of 656 proteins of peony

2.2 生物信息學分析

對HD和ZD樣品中656個蛋白質進行分析，得到顯著差異蛋白質77個，與HD相比較，ZD有24個蛋白質表達上調，53個蛋白質表達下調(圖4和表1)。

圖4 ZD/HD牡丹樣品中蛋白質火山圖和77個差異蛋白質聚類圖Fig.4 ZD/HD volcano plot of peony proteins and heatmap of 77 DEPs

對77個差異蛋白質進行GO、KEGG注釋及富集分析、蛋白質互作分析(protein-protein interaction，PPI)，參考生物為擬南芥。

2.2.1 GO注釋富集分析 GO分析已成為生物信息領域中一個重要的方法和工具，它通過利用本體所代表的生物學信息，從而實現了對生物體中各種基因組產物(例如基因、蛋白質等)生物學功能的描述[19]。

將77個DEPs與GO數據庫比對，分別注釋到生物學過程(biological process)、細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)；如圖5所示，DEPs在GOTerms上富集情況如下：在生物學過程中，富集最多差異表達蛋白質依次是“細胞代謝過程(cellular metabolic process)”12%、“有機物質代謝過程(Organic substance metabolic process)11%”、“初級代謝過程(primary metabolic process)”10%、“單一生物細胞過程(single-organism cellular process)”10%、“單一生物代謝過程(single-organism metabolic process)”8%，其余為“生物合同過程(biosynthetic process)”、“細胞成分組成(cellular component organization)”、“壓力響應(response to stress)”、“化學響應(response to chemical)”、“分解代謝過程(catabolic process)”等；在細胞組分中，富集最多DEPs是“細胞內部分(intracellular part)”20%、“細胞內(intracellular)”20%、“膜細胞器(membranebounded organelle)”17%等；在分子功能方面，富集最多DEPs的是“其他分子功能(other molecular function)”32%、“蛋白質結合(protein binding)”27%、“氧化還原活性(oxidoreductase activity)”18%、“輔助因子結合(cofactor binding)”8%、“核糖體結構組件(Structural constituent of ribosome)”8%等。

表1 顯著差異蛋白質相關代謝通路信息Table 1 Related metabolic pathway information of differential expression proteins

圖5 GO功能注釋及富集分析Fig.5 Functional annotation and enrichment analysis of Go function

2.2.2 KEGG注釋富集分析 為分析差異表達蛋白質參與的生物途徑，采用KEGG數據庫以DEPs進行生物功能途徑的富集分析。圖6所示，KEGG pathway富集到44個代謝通路，其中5條極顯著(P<0.01)代謝通路：“糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)”，“碳代謝(carbon metabolism)”、“丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)”、“三羧酸循環(citrate cycle TCA cycle)”、“丙酸代謝(Propanoate metabolism)”。基因圖表明，權重最高(大于0.8)的主要為：二氫硫酰胺脫氫酶(LPD1)、丙酮酸脫氫酶復合體(LPD2)屬于丙酮酸代謝通路；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPCP2)、葡萄糖-6-磷酸異構酶(PGI1)、丙酮酸激酶(PKP1)、丙酮酸激酶(At3g52990)屬于糖酵解通路；NADP-異檸檬酸脫氫酶(At5g14590)、線粒體琥珀酸-CoA連接酶β亞基(At2g20420)屬于三羧酸循環通路；HSP90-2、MED37A、RAD23B屬于內質網蛋白質加工；酮醇酸還原異構酶(At3g58610)屬于氨基酸生物合成通路；3-異丙基蘋果酸脫氫酶(IMDH2)屬于2-氧代羧酸代謝通路。

圖6 KEGG富集分析分布Fig.6 Distribution of enriched KEGG pathway

2.2.3 蛋白質互作分析PPI 最大節點數設定30，分數閾值0.7，差異表達蛋白質互作分析如圖7所示。互作最顯著20個蛋白質，涉及10個代謝通路，最顯著通路為糖酵解/糖異生。20個蛋白質為LPD1、At3g52990、LPD2、PKP1、At2g20420、PGI1、At3g58610、GAPCP2、NAD-ME1、IMDH2、MED37A、RAD23B、HSP90-2、CRT1、CDC48E、At5g14590、PYD2、HSP25.3、At5g28840、At5g47。

3 討論

3.1 代謝相關蛋白質

鮮花采摘后仍是一個有機生命體，脫離了母體和栽培環境后同化作用基本停止，但有機體仍在進行呼吸作用。干燥過程中，尤其是熱干燥下，會產生一系列代謝活動。本研究中ZD樣品與HD樣品的差異蛋白質主要涉及代謝相關通路(P<0.01)包括“糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)”，“碳代謝(carbon metabolism)”、“丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)”、“三羧酸循環(citrate cycle TCA cycle)”、“丙酸代謝(Propanoate metabolism)”。這五個通路是能量代謝的核心通路。能量和物質代謝是生物體基本的生命活動現象，一些共同的代謝反應如糖酵解、三羧酸循環以及一些氨基酸的合成等普遍存在于植物體內各個器官和組織中，這些代謝活動的強弱直接反應著植物的生存情況[20]。

糖酵解代謝(EMP)是碳水化合物代謝的主要途徑，是將葡萄糖和糖原降解為丙酮酸并伴隨著ATP生成的一系列反應，是一切生物有機體中普遍存在的葡萄糖降解的途徑，是葡萄糖進行有氧或無氧分解的共同代謝途徑。本研究中糖酵解通路中蛋白質主要是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPCP2)、葡萄糖-6-磷酸異構酶(PGI1)、丙酮酸激酶(PKP1、At3g52990)。丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是產生糖酵解途徑最終產物丙酮酸的關鍵調節酶。PK的底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和產物丙酮酸可參與多種代謝途徑，因此被認為在細胞代謝中發揮關鍵作用。PK是植物糖酵解和乙醛代謝途徑中的關鍵作用酶，可將ADP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)不可逆地轉化為ATP和丙酮酸[21]。PK、GAPCP2、PGI1的活性提高能促進糖酵解(EMP)、三羧酸循環(TCA)、磷酸戊糖途徑(PPP)途徑的運轉效率，保證了細胞的物質代謝和能量供應[22]。與烘干樣品比較，自然風干樣品中PGI1、GAPCP、PK顯著上調，表明自然風干過程中EMP顯著上調，產生更多能量。

二氫硫酰胺脫氫酶(LPD1)、丙酮酸脫氫酶復合體(LPD2)屬于丙酮酸代謝通路。丙酮酸進入線粒體，在丙酮酸脫氫酶的作用下，形成乙酰CoA，進入三羧酸循環。三羧酸循環是需氧生物體內普遍存在的代謝途徑，分布在線粒體[23]。NADP-異檸檬酸脫氫酶 (At5g14590)、線粒體琥珀酸-CoA連接酶β亞基(At2g20420)屬于三羧酸循環；這兩種酶顯著增加，表明自然干燥技術產生更多能量。

圖7 蛋白質互作分析Fig.7 Protein-protein interaction analysis

在能量代謝相關酶類中，3-異丙基蘋果酸脫氫酶(3-isopropylmalatedehydrogenase)(IMDH2)是一種亮氨酸生物合成中重要特定的酶，其是通過利用NAD+作為氧化劑催化(2R，3S)-3-異丙基蘋果酸的氧化和脫羧反應形成α-酮異己酸，生成NADH，其活性受二價金屬離子如Mg2+或Mn2+等的影響[24-25]。3-異丙基蘋果酸脫氫酶(IMDH2)參與幼果體內的糖代謝酶促反應，除了提供能量之外，產生的中間產物可以參與其它代謝反應，如通過中間產物草酰乙酸參與到氨基酸合成途徑中，進而合成蛋白質，影響內源激素的代謝[26]。

自然干燥和熱風干燥牡丹花，均為升溫過程，進行一系列生物體代謝，然而自然風干升溫溫和，機體內生物代謝劇烈；熱風干燥迅速升溫并保持70 ℃以上，該溫度會造成大多酶失活。

牡丹花受到高溫脅迫會產生大量的活性氧(ROS)，它們能破壞蛋白質的結構或功能，從而導致牡丹花氧化還原失衡、生理活動紊亂。抗氧化酶(CSD1、CSD3超氧化物歧化酶)可以清除自由基及過氧化物，從而使用細胞內氧化還原及生理活動恢復穩定狀態[27]。

3.2 Genetic information processing相關蛋白質

6個差異蛋白質涉及到“內質網蛋白質加工(protein processing in endoplasmic reticulum)”通路，其中最為重要是熱激蛋白。高等植物無法適應長期遭受超過45 ℃的高溫。在高溫脅迫條件下，植物細胞中蛋白質失去生物活性可能歸因于蛋白質聚集或蛋白質錯誤折疊或兩者都有。應激誘導的聚集和錯誤折疊蛋白的積累過程是不可逆的，而且對細胞功能造成傷害[28]。

翻譯后修飾主要是指蛋白質折疊、加工和降解，完成這一調節功能的主要是熱激蛋白類(Heat shock proteins，HSP)，它是一種分子伴侶，能夠穩定未變性蛋白，防止變性蛋白聚集或者幫助變性蛋白重折疊，幫助新生肽折疊成有功能的蛋白，協助使錯誤折疊的蛋白發生降解。HSP90家族的蛋白質占植物細胞總蛋白的1%～2%，其在細胞蛋白中是組成型表達，在非生物脅迫下(主要是高溫脅迫)，應激蛋白HSP90的表達程度與脅迫程度呈正相關[29-31]。同時，HSP90蛋白還具備一定的緩沖作用，如正常條件下，該基因不會被大量表達，然而當植物體受到環境脅迫，其緩沖作用就會體現出來，導致植物出現遺傳變異，進而有效適應不利環境[30]。研究表明HSPs在細胞內具有抗氧化的生物活性，其可以激活蛋白激酶，增強蛋白酶活性，促進SOD的生成，從而使細胞抗過氧化物的傷害，對細胞起修復和保護作用，從而有效提高機體的耐受性和抗應激能力[24]。

4 結論

本研究共定性蛋白質1423個，定量1349個，占總數的94.80%。FD、HD、ZD定量蛋白質分別為1325、677、1085個，三組樣品共有定量蛋白質656個。PCA和HCA分析表明，FD、ZD、HD樣品均各歸于一類，這表明加工方式對牡丹花蛋白質有顯著影響；同時凍干樣品與自然干燥又可以聚成一簇，表明兩組樣品蛋白質相似。

差異表達蛋白質DEPs的GO、KEGG注釋及富集分析，涉及到5個極顯著(P<0.01)代謝通路，其中最顯著代謝通路為“糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)”，“碳代謝(carbon metabolism)”、“丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)”、“三羧酸循環(citrate cycle TCA cycle)”、“丙酸代謝(Propanoate metabolism)”。自然風干樣品升溫緩和，PGI1、PKP1、GAPCP2、LPD1、LPD2顯著促進糖酵解、丙酮酸代謝、三羧酸循環等通路，讓牡丹花保持良好狀態；HSP90在內質網蛋白質加工通路中顯著增加，這表明細胞啟動應激反應，保持蛋白質穩定性。熱風干燥升溫劇烈，可能蛋白質在產生進一步生化反應之前，已經喪失活性。