牡蠣酸羊奶的工藝優化及其品質分析

劉 荔，謝 偉，徐錦錦，趙元暉

(中國海洋大學食品科學與工程學院, 山東青島266003)

牡蠣(Crassostrea gigas)素有“海中牛奶”之稱，是一種重要的海洋經濟貝類，具有調節機體免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血糖、降血脂等生物活性[1]。近年來，我國牡蠣產量逐年增加，2019年牡蠣養殖產量達523萬多噸[2]。牡蠣含有大量必需氨基酸和牛磺酸，是優質蛋白質的極佳來源。

目前，國內對于牡蠣的利用以傳統加工方式為主，一般為鮮品、干制品、調味品及凍制品等形式，產品附加值較低。國外主要是以牡蠣中的部分功能活性成分為基料，開發膠囊、片劑及提取液等功能保健品[3-4]，對于牡蠣肉的利用度較低。目前，很少有研究能夠將牡蠣肉全利用的同時高值化生產。牡蠣酶解液作為一種全牡蠣肉加工的產品，具有重要的經濟價值。但是牡蠣酶解過程中產生的苦味和牡蠣本身的腥味難以去除，影響牡蠣酶解產品的接受度[5]。如何提高牡蠣肉的利用度，開發出無殘渣、高值化的全牡蠣產品，是充分利用牡蠣肉加工的發展方向。

羊奶營養豐富、易吸收，被稱為奶中之王，是世界上公認最接近人奶的乳品[6]。其蛋白質多為β-酪蛋白,可有效降低人體對乳蛋白質的過敏[7]。此外，羊奶富含不飽和脂肪酸，更易被人體消化吸收，且具有重要的生理功效，能夠益智和促進視網膜的發育[8-9]。

本文研制了一種新型牡蠣酸羊奶，解決了牡蠣酶解液存在的腥苦味問題，實現了全牡蠣肉的加工利用。本產品不僅風味清香宜人、酸甜適口，同時還兼具了牡蠣和羊奶的雙重營養和生物活性，能夠滿足現代消費者對酸奶新型口味和高營養價值的追求，為牡蠣的高值化利用提供了一種新的方式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山羊奶 山東陽春羊奶乳業有限公司；新鮮牡蠣 山東省青島市團島農貿市場；中性蛋白酶(50000 U/g) 廣西東恒華道酶制劑公司；德氏乳桿菌保加利亞亞種(1.2717Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(1.2718Streptococcus thermophilus)、干酪乳桿菌(1.575Lactobacillus casei) 中國普通微生物菌種保藏中心；β-環糊精、阿拉伯膠、改性大豆卵磷脂 山東西王糖業有限公司；蔗糖 浙江仁和生物科技有限公司；MRS培養基、MRS肉湯培養基 青島海博生物技術有限公司。

Brookfield CT3質構儀 美國Brookfield公司；AR2000流變儀 美國TA Instruments公司；MJBL12X11粉碎機 美的生活電器有限公司；C21-21k01電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司；AR2130分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司；Multifuge X1離心機 美國Thermo Scientific Heraeus公司；BKQ-B50II立式滅菌鍋 山東博科消毒設備有限公司；PHSJ-3F實驗室pH計 上海雷磁儀器有限公司；DNP-9012電熱恒溫培養箱 上海巴玖實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 全牡蠣營養粉的制備 取新鮮牡蠣于4 ℃冰水浸泡30 min，重復4次。將脫鹽后的牡蠣按照料液比(v/v)為1∶2加水均質，使用蛋白酶(0.3%，50000 U/g)于50 ℃下酶解5 h，100 ℃沸水浴滅酶。冷卻后加入包埋劑攪拌2 h，4 ℃條件下水化過夜(包埋劑為阿拉伯膠∶β-環糊精∶改性大豆卵磷脂∶抗氧化劑=17%∶13%∶1.8%∶0.06%，抗氧化劑的成分是茶多酚∶鼠尾草提取物∶生育酚∶沒食子酸(w/w)=3∶1∶1∶1)。牡蠣包埋液過80目篩網，進行噴霧干燥，即得到全牡蠣營養粉。

1.2.2 酸奶制作工藝 酸羊奶：于200 mL羊奶添加4%～8%的蔗糖，并充分攪拌使其溶解。向混合液中接種4%～6%的乳酸菌種(保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌∶干酪乳桿菌(w/w)=2∶1∶1)，攪拌均勻并加蓋密封。混合發酵液在40～44 ℃下發酵8～10 h，于4 ℃保藏12 h。牡蠣酸羊奶：于200 mL羊奶添加6%～10%的全牡蠣營養粉、4%～8%的蔗糖，并充分攪拌使其溶解。后續操作同酸羊奶的制作。

1.2.3 單因素實驗 選用全牡蠣營養粉添加量(2%、4%、6%、8%、10%)、發酵劑添加量(3%、4%、5%、6%、7%)、蔗糖添加量(4%、6%、8%、10%、12%)、發酵溫度(40、41、42、43、44 ℃)、發酵時間(6、7、8、9、10 h)為主要考察對象，以酸度值和感官評分為評價指標進行單因素實驗，優化牡蠣酸羊奶制備工藝。初始發酵條件為全牡蠣營養粉添加量8%，發酵劑接種量4%，蔗糖添加量8%，發酵溫度42 ℃，發酵時間8 h。

1.2.4 正交試驗 基于單因素實驗結果，選擇4個主要影響因素：全牡蠣營養粉添加量、蔗糖添加量、發酵劑接種量和發酵溫度。以感官評價作為考察指標，采用L9(34)設計進行 4因素3水平正交試驗(表1)，以確定最優組合[10]。

表1 牡蠣酸羊奶發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels of oyster goat yogurt fermentation conditions optimization

1.2.5 牡蠣酸羊奶的感官評價 由10名固定的食品專業的老師和同學對兩種酸奶的外觀色澤、氣味、滋味、組織狀態進行評定，滿分為100分。酸奶樣品的準備條件為4 ℃下儲存24 h后取出，放置為室溫，在感官測試前30 min在小盤中制備樣品，每人盛放一茶匙[11]，具體的感官評價標準見表2。

1.2.6 牡蠣酸羊奶理化指標的測定 按照國標GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的方法測定蛋白質；脂肪含量的測定按照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》檢測；酸度采用滴定法測定，酸奶酸度(°T)為100 mL發酵乳消耗濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉的毫升數。

1.2.7 持水力的測定 稱量空的50 mL離心管，記為M0，向每個離心管中加入35 g酸奶，稱量其總重量為M1，在4 ℃條件下進行離心，4000 r/min，離心10 min。棄去上清液，稱量此時的總質量記為M2，每組設置5個平行試驗取平均值。持水力的計算公式為[12]：

1.2.8 表觀黏度的測定 使用AR2000型流變儀進行測定，椎板20，60 mm，流變模式為測定溫度25 ℃，剪切速率為0.1～100 s-1，樣品點選定為90個。結果以剪切速率為60 s-1時黏度表示。

表2 牡蠣酸羊奶的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of oyster goat yogurt

1.2.9 牡蠣酸羊奶總固形物含量的測定 按照國標GB/T 12143-2008《飲料通用分析方法》中的方法進行 測定。

1.2.10 牡蠣酸羊奶氨基酸含量的測定 按照國標GB 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》中的方法進行測定。

1.2.11 牡蠣酸羊奶脂肪酸含量的測定 使用含有0.005%丁基化羥基甲苯(抗氧化劑)的氯仿/甲醇(2∶1)萃取脂質，通過使用14%三氟化硼-甲醇試劑進行酯化。通過氣相色譜質譜(GC-MS)系統進行鑒定和定量，MS傳輸線和離子源溫度設置為250 ℃，檢測器溫度為260 ℃，程序初始溫度為150 ℃，保持3 min再以4 ℃/min從150 ℃設置為250 ℃，保持1 min，最后以10 ℃/min的速度升至260 ℃，最終保持時間為5 min。載氣流速為1.0 mL/min的氦氣。MS中的注入模式是電子撞擊(EI)模式，電離能為70 eV。根據檢測到的每種脂肪酸的相對MS峰面積(以內標為基準)計算結果[13]。

1.2.12 微生物指標的測定 大腸桿菌(Bacillus coli)的檢測：按照國標GB 4789.18-2010《食品微生物學檢驗乳與乳制品檢驗》中的平板計數法進行測定；乳酸菌的檢測：按照國標GB 4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中的稀釋平板法進行測定；致病菌由青島分析測試中心檢測完成。

1.2.13 質構的測定 采用BrookfieldCT3質構儀，選擇CT3質構儀及4500力量感應元(CT34500115)，方形家具基臺(TA-BT-KIT)。探頭選用40 mm直徑，170°淺角錐型探頭(TA54)，測試前探頭下降速度為10.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，測試后探頭回程速度為10.0 mm/s，返回高度為35 mm，觸發力為5 g[14]。

1.3 統計分析

每個實驗至少重復三次，取平均值。采用分析軟件IBMSPSS Statistics25進行多元方差分析和顯著性差異分析，以P<0.05表示差異顯著。以平均值±標準差表示結果，結合主成分分析法分析并使用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 牡蠣酸羊奶發酵條件的單因素實驗

2.1.1 全牡蠣營養粉添加量對牡蠣酸羊奶品質的影響 如圖1所示，當牡蠣粉的含量達到8%時酸度為86 °T，感官評分最高，為91分。因此確定最優的牡蠣粉添加量為8%。

圖1 全牡蠣營養粉添加量對牡蠣酸羊奶品質的影響Fig.1 Effects of the addition quantity of whole oyster nutritional powder on the quality of oyster goat yogurt

2.1.2 發酵劑添加量對牡蠣酸羊奶品質的影響 由圖2可知，當發酵劑的接種量為4%時，酸度適中，為87 °T，感官評分最高為91分，由此確定發酵劑的最佳接種量為4%。

圖2 發酵劑添加量對牡蠣酸羊奶品質的影響Fig.2 Effects of the addition quantity of start culture on the quality of oyster goat yogurt

2.1.3 蔗糖添加量對牡蠣酸羊奶品質的影響 適宜的添加蔗糖有利于改善酸奶的整體口感，避免酸度過低影響口感。如圖3所示，當蔗糖添加量達到6%時，酸度為89 °T，感官評分達到最高為93分，因此確定蔗糖的最適添加量為6%。

圖3 蔗糖添加量對牡蠣酸羊奶品質的影響Fig.3 Effects of sucrose addition on the quality of oyster goat yogurt

2.1.4 發酵溫度對牡蠣酸羊奶品質的影響 發酵溫度的適宜性與乳酸菌的生長繁殖密切相關，由圖4可知，當發酵溫度為42 ℃時，酸度為88 °T，感官評分分值最高為93分，因此選擇發酵溫度42 ℃作為牡蠣酸羊奶的最適發酵溫度。

圖4 發酵溫度對牡蠣酸羊奶品質的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature on the quality of oyster goat yogurt

2.1.5 發酵時間對牡蠣酸羊奶品質的影響 由圖5可得，發酵時間為8 h的牡蠣酸羊奶酸度為88 °T，感官評分分值最高為92分，酸度適宜，因此選擇發酵8 h作為牡蠣酸羊奶的最適發酵時間。

圖5 發酵時間對牡蠣酸羊奶品質的影響Fig.5 Effects of fermentation time on the quality of oyster goat yogurt

2.2 正交試驗優化牡蠣酸羊奶發酵條件

以感官評價作為考察指標，采用L9(34)設計的正交試驗結果如表3和表4所示，由F值可得各因素對于牡蠣酸羊奶的感官評分的影響從高到低依次是A>C>B>D，即全牡蠣營養粉添加量>蔗糖添加量>發酵劑接種量>發酵溫度。牡蠣酸羊奶的最優發酵工藝組合為A2B3C3D2，即全牡蠣營養粉的添加量為8%，發酵劑接種量為5%，蔗糖添加量為8%，發酵溫度為42 ℃。最適組合未出現在試驗組中，因此，對其進行驗證試驗。經驗證得到的牡蠣酸羊奶酸度為87.1 °T，感官評分為93分，帶有牡蠣清香，口感細膩，色澤均勻，整體呈淡黃色。

表3 牡蠣酸羊奶發酵條件正交試驗結果與分析Table 3 Orthogonal experimental results and analysis of oyster goat yogurt fermentation conditions

表4 正交試驗方差分析結果Table 4 Orthogonal experimental variance analysis results

如圖6所示，酸羊奶感官評分明顯低于牡蠣酸羊奶，這可能因為羊奶中富含中短鏈脂肪酸，產生膻味降低產品接受度[15]。牡蠣酸羊奶中由于全牡蠣營養粉的加入，同時包埋的壁材β-環糊精對羊奶有很好的除膻效果，整體氣味柔和怡人，黏稠度較好，感官分值明顯升高[16]。

圖6 牡蠣酸羊奶感官評分圖Fig.6 Oyster goat yogurt sensory score chart

2.3 牡蠣酸羊奶的理化指標檢測

在優化后的工藝條件下制備牡蠣酸羊奶，蛋白質、脂肪和酸度含量如表5所示，理化指標均符合國家標準GB 19302-2010 《食品安全國家標準發酵乳》。牡蠣酸羊奶的持水力和總固形物含量顯著高于酸羊奶(P<0.05)，兩種酸奶的蛋白質、脂肪含量和酸度、粘度無顯著性差異(P>0.05)。添加全牡蠣營養粉的酸奶蛋白質、脂肪含量增加，具有更高的營養價值，且黏度高、持水力強，口感更為豐富。

表5 牡蠣酸羊奶的理化指標結果Table 5 Physical and chemical index results of oyster goat yogurt

2.4 牡蠣酸羊奶的氨基酸檢測結果

如表6所示，添加全牡蠣營養粉發酵得到的牡蠣酸羊奶中，氨基酸總含量為3.36 g/100 g，與普通酸羊奶相比，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸的含量顯著增加(P<0.05)，這與牡蠣的氨基酸結果相一致[17-18]。必需氨基酸評分如表7所示，與普通酸羊奶相比，牡蠣酸羊奶氨基酸模式更接近人體蛋白質的氨基酸模式，即牡蠣酸羊奶更易被人體吸收利用。羊奶中自身含有豐富的蛋白質以及多種必需氨基酸[19]，但與標準模式相比所占比例較低；牡蠣酸羊奶中的蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸的模式比例均接近WHO/FAO標準模式，說明牡蠣酸羊奶的氨基酸豐富，且配比更加合理，具有較高的營養價值。

表6 牡蠣酸羊奶氨基酸檢測結果Table 6 Amino acid test results of oyster goat yogurt

表7 牡蠣酸羊奶中的必需氨基酸評分表Table 7 Scoring table of essential amino acids in oyster goat yogurt

2.5 牡蠣酸羊奶脂肪酸檢測

脂肪酸是評價食品營養的重要指標，據英國衛生部建議，人類飲食中的PUFA/SFA應高于0.45，并且n-6/n-3 PUFA的比例應不超過4.0[20]。如表8所示，牡蠣酸羊奶中含有17種脂肪酸，其中飽和脂肪酸(SFA)8種，單不飽和脂肪酸(MUFA)5種，多不飽和脂肪酸(PUFA)4種。單不飽和脂肪酸主要是C18:1(油酸)和C16:1，多不飽和脂肪酸主要是C18:2(亞油酸)和C18:3 n-3(亞麻酸)，飽和脂肪酸主要為C16:0，C18:0和C14:0。酸羊奶中的飽和脂肪酸以C14:0、C16:0、C18:0為主，奇數碳鏈的脂肪酸含量低，總體而言脂肪酸分布較為均衡[21]；與酸羊奶相比，牡蠣酸羊奶的SFA下降，MUFA中的C14:1、C16:1、C17:1、C18:1和PUFA中 的C18:2 n-6和C20:5 n-3顯著增加(P<0.05)。原因可能是牡蠣的添加和共同發酵增加了酸奶產品中不飽和脂肪酸的比例，從而降低了飽和脂肪酸的相對含量。此外，牡蠣酸羊奶的PUFA/SFA值為1.73，大于0.45，n-6/n-3 PUFA低于4.0，符合人類膳食標準。

表8 牡蠣酸羊奶脂肪酸檢測結果Table 8 Oyster goat yogurt fatty acid test results

2.6 牡蠣酸羊奶的乳酸菌活菌數

乳酸菌的數量能直接表示乳酸的發酵程度和營養價值[22]。國標規定：為保證乳酸菌在人體腸道中的存活率以發揮其保健性，每毫升酸奶產品中乳酸菌活菌數不得低于1×106CFU/mL[23]。如表9所示，優化后研制的牡蠣酸羊奶的活菌數為9.27 lg CFU/mL，普通酸羊奶的乳酸菌活菌數為8.42 lg CFU/mL。霉菌數、酵母數、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌，符合GB 19302-2010要求，說明將牡蠣與羊奶兩種原料共同發酵更有利于促進乳酸菌活菌數的增加。這是由于在混合菌種的發酵條件下，菌株之間的共生性促進總體活菌數的增加，而全牡蠣營養粉的加入進一步為乳酸菌的生長和傳代提供了豐富的營養物質。

表9 牡蠣酸羊奶乳酸菌活菌數測定結果Table 9 Results of determination of the number of viable lactic acid bacteria in oyster goat yogurt

2.7 牡蠣酸羊奶的質構特性及對比分析

酸奶的質構特性不僅會影響酸奶的整體口感，而且與酸奶的持水力以及儲藏期間的乳清析出率密切相關，一般稠度較高、黏度較大的酸奶，其持水力也較強[24]。結果如表10所示，與酸羊奶相比，牡蠣酸羊奶的粘合力、粘附性、稠度和硬度顯著增加(P<0.05)，在彈性上無顯著性差異(P>0.05)。原因可能是在發酵過程當中牡蠣被乳酸菌發酵利用，形成更為復雜而穩定的膠體結構，提高了整體的凝膠能力[25]。這表明添加全牡蠣營養粉后，提高了乳酸菌的發酵能力和對營養物質的利用程度，制成的牡蠣酸羊奶質地均勻、口感豐富，與感官評價的結果一致。

表10 牡蠣酸羊奶的質構結果Table 10 Texture result of oyster goat yogurt

采用主成分分析法(PCA)對酸羊奶和牡蠣酸羊奶的基本營養成分、質構特性、感官評分進行綜合分析。如圖7所示，PC1的貢獻率為76.9%，PC2的貢獻率為10.2%，兩種主成分共計87.1%(>85%)。所有指標相互關聯，均呈正相關關系，說明牡蠣酸羊奶的蛋白質、脂肪含量與質構特性以及最終的感官評分密切相關。牡蠣酸羊奶和普通酸羊奶的PC值沿第一主成分增大的方向分布較遠，即牡蠣酸羊奶在營養價值和質構性質上可與酸羊奶有效區分。綜合表10可以得到，加入全牡蠣營養粉的酸奶與未添加的相比營養價值提高，硬度、粘彈性增加，豐富了酸奶的營養和口感[26]。

圖7 牡蠣酸羊奶的營養及質構主成分分析圖Fig.7 The principal component analysis of texture of oyster goat yogurt

3 結論

本研究以牡蠣和純羊奶為主要原料，探討了制備牡蠣酸羊奶的最優工藝條件，并對其營養價值和品質進行分析。研究表明，牡蠣酸羊奶的最優發酵工藝為全牡蠣營養粉的添加量為8%，發酵劑接種量為5%，蔗糖添加量為8%，發酵溫度為42 ℃。此時得到的牡蠣酸羊奶酸度為87.1 °T，感官評分為93分，理化指標以及微生物指標均符合國家相關標準，氨基酸和不飽和脂肪酸含量豐富，質構方面黏度、彈性和硬度更加均衡。牡蠣酸羊奶營養價值高且品質均勻穩定，但其具體風味及滋味特性仍需要進一步的研究。本研究不僅豐富了酸奶市場，而且為牡蠣實現高值化利用，促進牡蠣新型產品的開發提供了理論依據。