魚鱗膠原蛋白提取殘渣中角蛋白的回收與表征

李秋雨，劉紅梅，李 彥，羅 燦，劉 焱,

(1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128；2.湖南省發酵食品工程技術中心，湖南長沙 410128；3.芷江侗族自治縣農業農村局，湖南芷江 419100；4.長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南長沙 410128)

角蛋白是一類具有保護功能的非營養性纖維狀硬蛋白，主要存在于動物的毛、發、角、爪及其他表皮結構中，其具有良好的生物活性、生物可降解性等，在醫藥、化妝品、生物材料等領域被廣泛應用。因角蛋白的來源主要以動物的毛發和蹄殼為主，具有一定的爭議性，使其原料來源在一定程度上受到了限制[1-5]。我國是水產品消費和生產的大國，每加工1000 t魚，就將產生20～30 t魚鱗副產物[6-8]。魚鱗中的蛋白質占其干重的70%，且蛋白質主要為膠原蛋白和角蛋白[9]。目前，有關魚鱗蛋白質方面的研究大部分都圍繞著膠原蛋白，關于角蛋白的研究很少，且提取膠原蛋白后的魚鱗殘渣被丟棄，仍會造成資源的浪費。2018年我國草魚產量達到550.43 t，湖南省草魚產量為60.23 t，占國內養殖量的10.94%，排名第三，草魚的加工量占其產量的18%～20%[10]。因此本研究從提取過膠原蛋白的魚鱗殘渣中提取角蛋白，不僅可以變廢為寶，充分地回收利用魚鱗，還能拓寬提取角蛋白的來源物，解決宗教信仰和產品安全性等方面的問題。

因此，本研究以提取過膠原蛋白的草魚魚鱗為原料，對提取草魚魚鱗角蛋白的最佳工藝進行探究，并對最佳工藝條件下提取的角蛋白進行表征，旨在從魚鱗殘渣中最大程度地回收角蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草魚魚鱗 收集于長沙馬王堆水產品市場；羊毛角蛋白標準品 Sigma Alderich公司；木瓜蛋白酶生化試劑 北京鼎國生物技術有限責任公司；丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250、Tris、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、檸檬酸、乙酸、溴酚藍 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

FTIR-7600型傅里葉紅外光譜儀 天津港東科技發展股份有限公司；UV2450型紫外分光光度計 島津(香港)有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；日立L-8 900型全自動氨基酸分析儀 天美(中國)科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 新鮮草魚魚鱗→預處理→酸法或酶法提取膠原蛋白→殘渣→蒸餾水清洗→堿法提取角蛋白

1.2.2 草魚魚鱗的預處理 稱取20 g新鮮的草魚魚鱗，用蒸餾水清洗干凈，在4 ℃條件下，依次用10%NaCl溶液、0.1 mol/L的NaOH溶液、1%的H2O2溶液分別處理12 h，然后用4%的檸檬酸溶液浸泡(料液比為1∶14)6 h。

1.2.3 膠原蛋白提取殘渣的制備

1.2.3.1 膠原蛋白含量測定 以經預處理后的魚鱗為原料，參照郭恒斌等[11]的方法，采用分光光度法對魚鱗中羥脯氨酸的含量進行測定。膠原蛋白的含量由測得的羥脯氨酸的含量乘以相關系數(14.2)即得。

1.2.3.2 不同酸法分離草魚魚鱗膠原蛋白 稱取20 g新鮮草魚魚鱗樣品2份，經預處理后分別用400 mL度為0.5 mol/L的乙酸溶液和0.5 mol/L的檸檬酸溶液于4 ℃下浸泡提取24 h后過濾。將5 mol/L的氯化鈉溶液添加到提取液，當樣液濃度為0.9 mol/L時停止添加氯化鈉溶液，然后靜置鹽析30 min，以4000 r/min的轉速離心20 min，沉淀再分別用上述的兩種酸溶液溶解后重復鹽析，經多次鹽析后的沉淀用對應的酸溶解后裝入透析袋中，用蒸餾水透析3 d，每4 h換水一次，透析完成，冷凍干燥后制得膠原蛋白樣品[12]。

1.2.3.3 不同酶法分離草魚魚鱗膠原蛋白 取20 g新鮮草魚魚鱗樣品2份，經預處理后分別加入400 mL含0.60 g胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液和含0.60 g胃蛋白酶的1%(質量濃度)的檸檬酸溶液，于4 ℃下浸泡提取24 h后過濾。后續操作參照1.2.3.2。

1.2.4 單因素實驗 分別考察NaOH濃度(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%)、料液比(1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15、1∶17.5、1∶20、1∶22.5、1∶25、1∶27.5)、提取溫度(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃)對角蛋白得率的影響。具體操作如下：提取膠原蛋白的魚鱗殘渣，按單因素條件處理后置于70 ℃下提取，直至魚鱗殘渣充分溶解后過濾。濾液pH用濃鹽酸調至魚鱗角蛋白等電點(pI=6.7)，室溫下靜置30 min，轉速4000 r/min，沉淀用對應濃度的NaOH溶液溶解，溶解后裝入透析袋中用超純水透析，每4 h換水一次，透析3 d，冷凍干燥，稱重，比較其得率大小[13-15]。

1.2.5 正交試驗 在單因素實驗的基礎上，以角蛋白的得率為指標，探究氫氧化鈉濃度、料液比、提取時間對角蛋白得率的影響。設計三因素三水平的正交試驗，見表1。

表1 草魚魚鱗角蛋白提取工藝L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and level table for L9(34) orthogonal test of grass carp scales keratin extraction process

1.2.6 膠原蛋白去除率和角蛋白得率的計算

式中：m1：提取的膠原蛋白的質量，mg；m2：魚鱗中膠原蛋白含量，mg；m3：提取膠原蛋白后魚鱗殘渣的質量，mg；m4：提取的角蛋白的質量，mg。

1.2.7 草魚魚鱗角蛋白的鑒定與分析

1.2.7.1 紫外光譜分析 準確稱取10 mg純化的魚鱗角蛋白，用0.1 mol/L NaOH溶液將其溶解，然后定容至50 mL，制成0.2 mg/mL樣液，于200～400 nm處進行光譜掃描，記錄結果，與角蛋白標準品的紫外圖譜進行對照，分析試驗結果。

1.2.7.2 電泳分析 采用 SDS-PAGE 凝膠電泳對草魚魚鱗的角蛋白進行分析鑒定[16-18]。采用SDS-PAGE垂直平板電泳，凝膠厚度1.5 mm，分離膠8%，濃縮膠5%，樣品上樣量20 μL。

1.2.7.3 傅里葉紅外光譜分析 將冷凍干燥后的魚鱗角蛋白樣品適量與少量溴化鉀混合壓片，然后進行紅外光譜掃描，波數設定在400～4000 cm-1間，再分析圖譜和試驗結果。

1.2.7.4 氨基酸組成分析 采用氨基酸分析儀分析草魚魚鱗角蛋白中氨基酸的組成及含量。其檢測條件為離子交換柱：26 mm×150 mm；分離柱柱溫：53 ℃；進樣體積：50 μL；洗脫液：IPH-1、2、3、4；泵流速：0.225 mL/min；分析時間：72 min。

1.3 數據處理

各組實驗數據均重復3次，數據采用平均值±標準偏差的表示方式，用DPS2018進行統計學分析，用Origin 2018軟件進行繪制試驗結果圖。

2 結果與分析

2.1 不同分離方法分離膠原蛋白的結果分析

2.1.1 不同分離方法分離膠原蛋白的效果分析 采用不同的方法分離草魚魚鱗膠原蛋白，對其去除率進行分析比較，探究不同分離方法對膠原蛋白去除效果的影響，結果如表2所示。

表2 不同分離方法的膠原蛋白去除率Table 2 Collagen removal rate of different separation methods

經測定，新鮮草魚魚鱗中膠原蛋白的含量為2.147 g/20 g。從表2可以看出，四種方法分離草魚魚鱗膠原蛋白的去除率存在顯著性差異(P<0.05)，四種方法中，乙酸法分離草魚魚鱗膠原蛋白的去除率最低，為34.65%，檸檬酸法的去除率為40.80%，乙酸-胃蛋白酶法的去除率為70.24%，檸檬酸-胃蛋白酶法分離的膠原蛋白去除率最高，為87.94%。通過分析上述數據可知，單獨的酸法分離膠原蛋白的去除率均較低，而在酸法的基礎上添加胃蛋白酶來分離膠原蛋白其得率明顯升高。因此可知，為更好地將魚鱗中的膠原蛋白去除，四種方法中選擇檸檬酸-胃蛋白酶法。

2.1.2 不同分離方法對膠原蛋白結構的影響 膠原蛋白二級結構變化的敏感區域是由于由C=O伸縮引起的酰胺Ⅰ帶，其波數范圍為1700～1600 cm-1。從圖1可以看出，乙酸法和乙酸-胃蛋白酶法提取的魚鱗膠原蛋白在1647 cm-1附近出現特征吸收峰，對應無規卷曲結構，這表明乙酸法和乙酸-胃蛋白酶法提取的膠原蛋白的酰胺Ⅰ帶不具備三螺旋結構特征；檸檬酸法和檸檬酸-胃蛋白酶法提取的魚鱗膠原蛋白在1655 cm-1附近出現特征吸收峰，對應α-螺旋結構，這表明檸檬酸法和檸檬酸-胃蛋白酶法提取的膠原蛋白的酰胺Ⅰ帶具備三螺旋結構的特征。而四種方法提取的膠原蛋白在3325、3080、1545和1238 cm-1附近均出現特征吸收峰，其對應的三螺旋結構相同。綜上可知，乙酸法和乙酸-胃蛋白酶法提取的膠原蛋白的三螺旋結構部分被破壞，結構保存不完整，而檸檬酸法和檸檬酸-胃蛋白酶法提取的膠原蛋白結構保存完整。結合前文中膠原蛋白去除率的大小可知，采用檸檬酸-胃蛋白酶法分離膠原蛋白的效果最好。因此，后續試驗所用的原料為檸檬酸-胃蛋白酶法去除膠原蛋白后的殘渣。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 不同NaOH濃度對角蛋白得率的影響 由圖2可知，角蛋白的得率隨著NaOH濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢。當NaOH的濃度小于8%時，魚鱗角蛋白得率隨著NaOH濃度的增大不斷增大，當濃度達到8%時，角蛋白的得率最大，為4.56%。當NaOH濃度大于8%后，隨著NaOH的濃度逐漸增加，角蛋白得率不斷降低。因而NaOH濃度為8%時，角蛋白的得率最大。

2.2.2 不同料液比對角蛋白得率的影響 從圖3可知，隨著料液比增大，魚鱗角蛋白得率先增加后降低，角蛋白得率最大，為4.16%，此時的料液比是1∶15。這可能是由于料液比的增大，相當于稀釋了反應體系中的底物，增加物質反應面積，直至角蛋白的得率增加到最大值。此后隨著溶劑濃度的增加，反應物稀釋過大，阻礙了提取反應的進行，使角蛋白的得率降低。因此，當料液比為1∶15時，角蛋白的得率最大。

2.2.3 不同提取溫度對角蛋白得率的影響 從圖4可知，隨著提取溫度的升高，草魚魚鱗角蛋白得率先增加后緩慢降低，提取溫度為60 ℃時，角蛋白得率達到最大值，為4.82%，此時，此后提取溫度再升高，角蛋白得率緩慢降低。角蛋白得率降低的原因可能是當溫度過高時，角蛋白的分子結構被破壞，導致其得率降低。由此可以確定，提取溫度為60 ℃時，角蛋白的得率最大。

2.2.4 正交試驗結果 以草魚魚鱗角蛋白的得率為試驗指標，進行正交試驗，結果如表3所示。由表3正交試驗結果可知，影響角蛋白提取的三種因素中，因素的主次比結果為提取溫度>氫氧化鈉濃度>料液比。通過結果分析可知，試驗的最佳的組合是A3B1C2，然后在相同條件下進行驗證試驗，平行3次，測得草魚魚鱗角蛋白的得率為6.031%，高于正交試驗表中的最佳組合A3B3C2(角蛋白得率5.833%)，因此可以確定草魚魚鱗角蛋白的最佳提取工藝為A3B1C2，即在60 ℃的條件下，料液比為1∶12.5，以9%的NaOH溶液為提取液進行提取。

圖1 不同方法分離的膠原蛋白的傅里葉紅外光譜圖Fig.1 Fourier transform infrared spectra of collagen isolated by different methods

圖2 NaOH濃度對角蛋白得率的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on keratin yield

圖3 料液比對角蛋白得率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on keratin yield

圖4 提取溫度對角蛋白得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on keratin yield

表3 L9(34)正交試驗結果Table 3 L9(34) orthogonal test results

2.3 草魚魚鱗角蛋白鑒定分析結果

2.3.1 紫外光譜分析結果 從圖5中可知，草魚魚鱗角蛋白和羊毛角蛋白標準品的圖譜在200～400 nm范圍內均出現2個明顯的吸收峰，魚鱗角蛋白吸收峰的位置分別在218.2 nm及280.4 nm處，和羊毛角蛋白吸收峰的位置相近，但吸收峰的強度稍低于羊毛角蛋白。由此可以得出，草魚魚鱗角蛋白的峰譜符合羊毛角蛋白標準品的峰譜特征。

圖5 紫外分析圖譜Fig.5 Ultraviolet analysis spectrum

2.3.2 電泳分析的結果 從圖6可以看出，在分子量48 kDa附近出現了一條清晰的電泳條帶。其分子量大小與羊毛角蛋白分子量大小沒有明顯差異性，符合角蛋白的分子量特征[19-20]。

圖6 草魚魚鱗角蛋白電泳分析結果Fig.6 Electrophoresis analysis result of grass carp scales keratin

2.3.3 紅外光譜分析結果 通常以酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶這3處是否有特征吸收峰作為角蛋白二級結構完整性的評判依據[21-23]，從圖7得出，角蛋白的特征吸收峰在1653.00、1525.69、1238.30、459.06 cm-1處，該特征峰出現的位置分別是由于伯酰胺的C=O伸縮振動、仲酰胺的C=O伸縮振動、羧基中的C-O伸縮振動、二硫鍵S=S伸縮振動吸收造成的，特征吸收峰出現的位置表示其二級結構保存完整[24-25]。角蛋白的二級結構中，α-螺旋是在1657～1651 cm-1處，β-折疊是在1694～1680 cm-1和1631～1621 cm-1處，無規卷曲是在1697～1670 cm-1處，魚鱗角蛋白的特征吸收峰出現在1653 cm-1處，符合角蛋白結構中的α-螺旋結構的特征[26-27]。

圖7 草魚魚鱗角蛋白紅外分析圖譜Fig.7 Fourier infrared spectrum analysis result of grass carp scales keratin

2.3.4 氨基酸組成鑒定結果 從表4可知，兩種角蛋白中均檢測出18種氨基酸，其中有7種必需氨基酸，且兩種角蛋白中均未檢測出羥脯氨酸。魚鱗角蛋白中的胱氨酸占總氨基酸含量的14.9%，與角蛋白中含有豐富的胱氨酸，其占總氨基酸的14%～15%的研究結果相符[28-29]。研究表明，膠原蛋白的特征氨基酸為羥脯氨酸，且不含色氨酸，而含有大量的甘氨酸，占總氨基酸的三分之一[30-32]。而從表4中可以發現，魚鱗角蛋白樣品中雖檢出甘氨酸，但其含量僅占總氨基酸的7.69%，且膠原蛋白的特征氨基酸未見檢出。與羊毛角蛋白相比，除組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、精氨酸含量差異大于2 g/100 g外，其他氨基酸含量無較大的差異(含量差小于2 g/100 g)。綜上可知，草魚魚鱗角蛋白的氨基酸組成和含量基本符合羊毛角蛋白的氨基酸組成和含量的特征。

表4 氨基酸的組成及含量(g/100 g)Table 4 Amino acid analysis results of grass carp scale keratin (g/100 g)

3 結論

本研究結果表明，檸檬酸-胃蛋白酶法去除膠原蛋白的去除率最高，為87.94%，去除的膠原蛋白結構保存完整。提取角蛋白的最優工藝條件：NaOH濃度9%、料液比1∶12.5、提取溫度60 ℃。在該最優工藝條件下，對提取的目的蛋白進行鑒定和分析，結果發現：魚鱗角蛋白吸收峰出現的位置在218.2、280.4 nm處，與羊毛角蛋白的出峰位置相似；凝膠電泳分析顯示，魚鱗角蛋白的相對分子質量在48 kDa左右，符合角蛋白的分子量特征；傅里葉紅外光譜分析顯示目的蛋白的二級結構屬于α-螺旋結構，此蛋白質屬于α-角蛋白。氨基酸組成分析表明所提取的蛋白質的氨基酸組成與角蛋白的特征基本相符。綜上可知，從提取過膠原蛋白的魚鱗殘渣中提取的蛋白質為α-角蛋白。本研究在保證膠原蛋白提取率最大及結構保存完整的條件下，對魚鱗殘渣中的角蛋白進行提取，對充分回收利用角蛋白具有重大的意義。