庫車小白杏混菌乳酸發酵工藝優化及其發酵動力學模型

王旭光，茹先古麗·買買提依明，徐曉培，白 琳，王 亮，劉 軍，艾合買提江·艾海提

(新疆大學生命科學與技術學院, 新疆維吾爾自治區烏魯木齊 830046)

杏是世界上最受歡迎的水果之一，屬于薔薇科，富含維生素、碳水化合物、有機酸和人體必需礦物質[1-2]。新疆庫車地區小白杏資源豐富，但庫車小白杏成熟期短，且新鮮杏的保質期僅為3～5 d，易腐爛變質，難以儲存和運輸，以致每年損失約11%。目前通常將杏子加工為罐頭以延長保存時間[3]，除此之外，它的開發和利用非常有限。

果汁可以作為良好的益生菌培養基[4]，且乳酸菌發酵可以保持水果的營養和感官，并提高水果的貨架期[5-6]。目前，已有關于水果和蔬菜的乳酸菌發酵的研究報道，如哈密瓜汁[7]、石榴汁[8]、腰果梨汁[9]、菠蘿汁[10]和土豆汁[11]。經常食用益生菌有很多好處，如調節腸道功能、改善乳糖消化、增強免疫系統、抑制病原體和抗腫瘤[12]。食品的原料成分可以通過乳酸發酵得到改善，產生具有更高生物活性的衍生化合物[13-14]，如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性可通過乳酸發酵得到增加[15]。SOD是抵抗ROS降解作用的一系列抗氧化酶的第一道防線，因此它具有極其重要的生理意義[16]。水果中的L-蘋果酸會使發酵液具有尖刻的酸草味[17]。而乳酸菌可以將L-蘋果酸作為底物將其代謝為CO2和感官較柔和的L-乳酸[18-19]，所以利用乳酸發酵可將果汁加工成風味更理想的飲料[20]。

基于上述考慮，本研究以庫車小白杏為原料，以SOD活力和感官評分為指標，通過響應面法優化小白杏混菌(植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌)乳酸發酵工藝，并建立發酵動力學模型，為庫車小白杏乳酸發酵提供理論基礎。以期開發健康營養的飲料產品，并以此來減少庫車小白杏采摘后損失。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小白杏 新疆自治區庫車縣；兩種乳酸菌(植物乳桿菌bio-52467和羅伊氏乳桿菌bio-53258) 中國微生物菌種保藏中心；果膠酶(酶活為50 U/mg)、纖維素酶(酶活為50 U/mg)、半纖維素酶(酶活為20 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司；保鮮膜(規格30 cm×20 m) 購于當地超市。

RBM-767S型高端破壁料理機 廣州隆特電子有限公司；UV752N紫外-可見分光光度計 德國耶拿分析儀器股份公司；DK-600A型電熱恒溫水浴鍋 北京市光明醫療儀器有限公司；BSA224S電光學天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；TDL-5M臺式低速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小白杏果漿的制備 小白杏在中國新疆庫車縣果園進行人工采摘，使用前在4 ℃冷藏。通過打漿機打漿后將果漿加熱至55 ℃以進行酶解。酶添加量為3‰，果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶的比例為2∶1∶1。然后放入500 mL無菌錐形瓶中，在100 ℃滅菌20 min。隨后冷卻至36 ℃待用。

1.2.2 微生物培養 將菌種在MRS肉湯培養基中于36 ℃厭氧培養24 h。活化后，培養至第三代菌。初始菌濃度約為8.0 lg CFU·mL-1。將菌液保持在4 ℃待用。

1.2.3 單因素實驗 在本研究中，選擇羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌進行混合培養。研究了四個主要影響因素：溫度28.0、32.0、36.0和40.0 ℃)，菌種比例(植物乳桿菌∶羅伊氏乳桿菌)(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)，接種量(1.0%、3.0%、5.0%、7.0%和9.0%)和發酵時間(20、24、28、32和36 h)。發酵結束后測定SOD活力和感官評分。除研究因素外，其他條件為36 ℃，菌種比例為3∶1，接種量為5.0%，時間為28 h。所有發酵樣品均一式三份置于不同溫度下進行靜置發酵。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上，使用中心組合實驗設計(central composite experimental design，CCD)研究溫度(X1，℃)、菌株比例(X2，(v/v))、接種量(X3，%)和發酵時間(X4，h)的線性、交互作用和平方效應。使用Design-Expert 8.0.6(Stat-Ease Inc.，USA)軟件進行分析。表1中提供了自變量的水平及其編碼值。使用全因子CCD進行30組實驗優化了發酵條件。因變量(Y)是杏汁的SOD活力(Y1，U/g)和感官評分(Y2)，將其擬合得到二次模型(式1)：

1.2.5 成分分析 杏汁中的總可溶性固形物(Total soluble solids，TSS)用折光儀測定，并以°Brix表示；pH通過臺式酸度計測量；SOD活力使用SOD試劑盒測定；總糖、總酸含量根據GB/T 15038-2006測定；菌濃度測定使用血細胞計數板進行計數；按照GB/T 4789.3-2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》規定方法對大腸菌群進行測定。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.6 感官分析 根據Matej?eková等[21]描述的方法，對小白杏乳酸發酵液進行詳細的感官評估和定量描述分析(QDA)。此方法可以獲得詳細完整的產品感覺描述，從而清楚地顯示產品之間的差異。感官分析包括顏色、杏子味、甜度、酸度、澀味和香氣(見表2)。發酵液樣品的感官指標分為10個等級(1和10分別表示“極度不喜歡”和“極度喜歡”)。以6項分數之和代表感官評分(總分60分)。

1.2.7 發酵動力學模型 文獻中已經報道了關于微生物發酵的各種動力學模型[22]。也已被證明能夠描述各種實驗條件和培養基[23]。對于細胞生長動力學和代謝物生成動力學，logistic方程是一個“S”型曲線模型，該模型可以很好地描述發酵系統中細胞生長和代謝物的生成過程[24]。Logistic方程如下(式2)：

式中：i分別代表1(菌濃度)、2(SOD活力)；Z1為菌濃度，lg CFU·mL-1；μ1m為最大比生長速率，h-1；Z1m為最大菌濃度，lg CFU·mL-1；Z10為初始菌濃度，lg CFU·mL-1；Z2為SOD活力，U/g；μ2m為最大比生成速率，h-1；Z2m為最大SOD活力，U/g；Z20為初始SOD活力，U/g；t為發酵時間，h。

1.3 數據處理

所有樣品分析均重復三次。單因素實驗的數據表示為平均值±標準差，使用軟件SPSS/PC13.0版(SPSS Inc.，Chicago，IL，美國)進行統計分析；使用Design-Expert V8.0.6進 行 響 應 面 設 計；使 用GraphPad Prism 8進行發酵動力學模擬并繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 發酵溫度對SOD活性和感官評分的影響 如圖1(a)所示，溫度對SOD活性和感官評分有明顯影響。結果表明，當溫度低于36 ℃時，SOD活性和感官評分均隨溫度的升高而顯著增加(P<0.05)。在36 ℃時，SOD活性和感官評分同時達到最高(307.36 U/g和51分)。但在40 ℃時，SOD活性和感官分數降低。這是因為40 ℃的條件使乳酸菌活性降低，導致SOD活性隨之降低。根據文獻報道報告，乳酸菌的活性取決于許多因素，尤其是溫度，不同乳酸菌的最佳溫度范圍均低于37 ℃[25-26]。因此，在隨后實驗中，選擇36 ℃作為最佳發酵溫度。

2.1.2 菌種配比對SOD活性和感官評分的影響 圖1(b)顯示菌種配比對SOD活性和感官評分有顯著影響(P<0.05)。數據顯示，當菌種配比為3∶1時，SOD活性和感官評分均達到最高水平。但是，當菌種配比從3∶1到5∶1時，SOD活性開始從305.60 U/g下降到259.47 U/g，感官評分從50.76分降低到45.35分。結果表明，兩種乳酸菌之間的協同作用在3∶1時效果最高。因此，所需的菌種配比應為3∶1。

2.1.3 接種量對SOD活性和感官評分的影響 從圖1(c)可以看出，接種量對SOD活性和感官有重要影響。接種量為1.0%時，SOD活性最低，為244.38 U/g。當接種量在1.0%～5.0%之間時，SOD活性隨接種量的增加而增加，在接種量5%時達到最高值，為306.99 U/g。接種量從1.0%增加到3.0%時，感官評分增高，但隨后繼續增加接種量時，感官評分沒有顯著差異(P>0.05)，均顯示出較高水平。但當接種量繼續增加至9.0%時，SOD活性從306.99 U/g顯著下降至256.61 U/g(P<0.05)；這意味著接種量過大時，會加劇細菌的種內斗爭，降低細菌活性。因此，之后實驗的接種量選擇為5.0%。

2.1.4 發酵時間對SOD活性和感官評分的影響 如圖1(d)所示，發酵時間在20～36 h范圍內明顯影響SOD活性，SOD活性在發酵28 h達到最高，為309.60 U/g。但隨著發酵時間的延長，SOD活性在36 h降低到242.67 U/g。而感官評分則在發酵的第32 h獲得最高分數53.8分，但此時SOD活力過低。較短的發酵時間會導致較低的菌濃度，這導致杏汁中的SOD活力較低，且由于蘋果酸消耗不足導致口感較差。根據報道，由于在發酵過程中機體過多生長和有機酸積累，益生菌會逐漸失去活性[27]。在培養24 h后，乳酸菌可以達到最高菌濃度[28]。另一方面，當細菌的濃度過高時，種內斗爭增加，導致益生菌的代謝減少。因此，小白杏最佳發酵時間定為28 h。

表2 小白杏發酵液感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria for apricot fermentation juice

圖1 發酵溫度(a)、菌種配比(b)、接種量(c)和發酵時間(d)對小白杏發酵液SOD活性和感官評分的影響Fig.1 Effect of temperature (a), strains proportion(b),inoculum size(c) and time (d) on SOD activity and sensory evaluation of fermentation of apricot juice

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果 單因素實驗表明，小白杏乳酸發酵過程中溫度、菌株配比、接種量和時間對發酵液中SOD活性和感官評分有較大影響。表3顯示了全因子CCD的30組實驗，發酵過程按標準順序排列。通過多元回歸分析對響應函數(Yi)進行擬合，可以得到以下二階多項式方程，這些方程可以完全代表SOD活性(Y1)和感官評分(Y2)。

表3 小白杏乳酸發酵中心復合設計(CCD)及實驗結果Table 3 Central composite experimental design (CCD) and experiment results for lactic acid fermentation of apricot juice

表3和表4分別顯示了SOD活性和感官評分的實驗結果和方差分析。模型F值分別為42.57和61.56，P<0.0001，表明這兩個模型均顯著。失擬項的P值分別為0.1039和0.2453，P>0.05，表明該模型可以充分模擬小白杏乳酸發酵過程。此外，所有反應變量的R2值均大于0.95，表明回歸模型很好地模擬了發酵過程。可以看出，兩個模型均很好地描述了每個因素與響應值之間的真實關系，可以用來確定最佳發酵過程。

表4 中心復合設計(CCD)實驗結果的方差分析Table 4 Analysis of variance for the experimental results of the CCD

2.2.2 SOD活性響應面分析 表3方差分析結果表明，交互項X1X2、X1X3和X2X4影響極顯著(P<0.01)，X2X3影響顯著(P<0.05)，說明交互作用對小白杏乳酸發酵中SOD活性有顯著性影響。

圖2(a，b，c，d)是小白杏乳酸發酵各變量的交互作用對SOD活性(Y1)影響的3D響應面圖。若響應曲面傾斜度越高，等高線越接近橢圓形，則說明交互作用越強[29]。圖2(a)顯示了發酵溫度和菌株配比的交互作用對SOD活性的影響。隨著溫度的升高，SOD活性在32～36 ℃范圍內增加，在36～38 ℃達到峰值，此時菌株配比約為2∶1。圖2(b)顯示了發酵溫度和接種量的交互作用對SOD活性的影響。表明SOD活性在36～37 ℃達到峰值，此時接種量為4.0%～6.0%。圖2(c)顯示了菌種配比和接種量的交互作用對SOD活性的影響。當接種量在5.0%左右時，SOD活性最高，此時菌種配比約為2∶1。圖2(d)顯示了菌種配比和發酵時間的交互作用對SOD活性的影響。當發酵時間在30 h，且菌株比例為2∶1時，SOD活性最高。由響應面圖可以看出，交互項X1X2、X1X3、X2X3和X2X4影響顯著，與方差分析結果一致。

2.2.3 感官評分響應面分析 由表3方差分析結果可知，交互項X1X2和X1X4的交互作用影響顯著(P<0.05)，其他交互項則不顯著。

圖2(e)顯示了發酵溫度和菌種配比的交互作用對感官評分的影響。在發酵溫度為37 ℃左右，菌種配比為2.5∶1時，具有最高感官評分。發酵溫度和發酵時間的交互作用對感官影響如圖2(f)所示。當發酵溫度為37 ℃時，感官評分最高，此時發酵時間約為30 h。由響應面圖可以看出，交互項X1X2和X1X4的交互作用影響顯著，與方差分析結果一致。

2.3 驗證試驗

使用Design-Expert 8.0.6軟件優化發酵條件，即發酵溫度(36.71 ℃)、菌種配比(2.61∶1)、接種量(4.9%)和發酵時間(29.86 h)。為了便于實際操作，將最佳發酵條件設置如下：溫度(37.0 ℃)，菌種配比(2.6∶1)，接種量(5.0%)和時間(30 h)。該模型的預測響應值：SOD活性為308.46 U/g，感官評分為53.80分。進行重復實驗以驗證預測模型得出：實際的SOD活性和感官評分分別為309.60 U/g和54.18分，相對誤差分別為0.37%和0.71%，表明預測值與實際值之間沒有明顯差異。

2.4 品質指標分析

發酵結束后，發酵液呈現金黃色，色澤均勻有光澤，口感柔和，酸甜適中，無明顯澀味，有小白杏香味。測得杏汁中：TSS為16.3 °Brix，總糖為141.30 g/L，總酸為8.20 g/L，pH為3.91，SOD活性為309.60 U/g。大腸桿菌菌群<3 MPN/100 mL，未檢出致病菌。

2.5 發酵動力學參數擬合

小白杏乳酸發酵動力學如圖3(a)所示，乳酸菌濃度在最初的12 h內迅速從6.08 lg CFU·mL-1增加到8.30 lg CFU·mL-1。在24 h時達到最高濃度，大約為8.69 lg CFU mL-1。繼續延長發酵時間，細菌濃度趨于穩定。這與已知報告結論一致[8]。SOD活性變化趨勢與菌濃度基本相同，在發酵的第24 h達到最大值315.88 U/g，隨后稍微下降，最終SOD活性為308.46 U/g。

從實驗結果中得出菌濃度的初始值和最大值分別為6.08和8.69 lg CFU·mL-1；SOD活性的初始值和最大值分別為85.15和315.88 U/g。表5總結了動力學參數和模型方程，模型的R2分別為0.9970和0.9913。菌體生長和SOD生成動力學擬合曲線和驗證值如圖3(b)所示，動力學模型的預測值曲線與驗證值的吻合程度均較好，因此，在該發酵條件下，Logistic方程可以很好地描述乳酸菌生長和SOD生成的動力學。

3 結論

本研究得到最佳發酵工藝參數為：發酵溫度37.0 ℃，植物乳桿菌：羅伊氏乳桿菌為2.6∶1，接種量5.0%，發酵時間30 h。在此條件下，杏汁中SOD活性為 309.60 U/g，感官評分為54.18分，與理論預測值的308.46 U/g和53.80分，相對誤差分別為0.37%和0.71%；使用Logistic方程對小白杏乳酸發酵動力學進行研究，動力學模型的預測值與實驗值的擬合度分別為0.9970、0.9913，說明擬合效果良好，能很好地模擬小白杏乳酸發酵過程的動力學特性。通過優化庫車小白杏的混菌發酵工藝和發酵動力學研究，可以進行工業化生產，有效減少小白杏采摘后損失。

圖2 各因素交互作用的三維響應面圖Fig.2 3D response surface of various factors for their mutual interaction

表5 小白杏乳酸發酵動力學模型參數Table 5 Sensory evaluation criteria for apricot fermentation juice

圖3 小白杏乳酸發酵動力學及其擬合曲線Fig.3 The lactic acid fermentation kinetics and its fitting curve of apricot