基于高通量測序技術分析預包裝豆干生產過程中的真菌污染風險

趙麗君，田 雪，鐘 威，賈利蓉, ，段飛霞,

(1.四川大學輕工科學與工程學院食品工程系, 四川成都 610065；2.四川徽記食品股份有限公司, 四川成都 610083)

大豆在我國有五千多年的栽種歷史，我國也是大豆加工制品的發源地。豆干作為我國典型的傳統豆制品，營養豐富，在我國餐桌和休閑食品市場占有重要份額[1]，并持續增長。2019年休閑豆干制品市場份額已達190億元以上，整個豆制品行業2019年銷售額和效益普遍增長，增幅高達15%[2]。隨著市場需求增加，生產規模不斷擴大，豆干生產從最初的作坊式加工逐步轉向工業化、自動化(或半自動化)生產，為產品質量控制和食品安全保障提供了生產條件支撐[3]。

豆干制品加工工序復雜，從原料到成品需要經過浸泡、研磨、凝固、鹵制、烘烤、包裝等數十道工藝，給加工過程帶來了極大的微生物污染風險[4-7]。豆干產品中致腐菌包括細菌和真菌(酵母菌和霉菌)[8]，現有研究主要針對豆制品產品中的腐敗細菌[9]，對產品及加工過程中真菌污染風險研究較少。此外，大豆及其制品是真菌繁殖的優良培養基，為真菌增殖提供了有利條件[10]。豆制品原料、食品接觸的設備表面及加工人員等均可能成為引入真菌污染的源頭[11]。真菌污染不僅導致產品腐敗，生產過程中真菌毒素的產生和殘留也為豆制品的食品安全埋下隱患[12]。因此，明確豆干加工過程中的主要污染真菌，并與豆干終端滅菌工藝、產品貨架期建立聯系，對豆干制品食品安全保障及品質控制具有重要價值。

二代高通量測序技術采用邊合成邊測序的方法，能同時測定上百萬條DNA分子序列，精度高達99.99%，彌補了一代測序技術成本高，檢測時間長的缺點，也彌補了傳統分離培養鑒定手段的通量小、信息少、操作復雜的缺點，具有高準確性、高通量、高靈敏度和低運行成本等突出優勢[13-14]，為全面、快速、準確的了解豆干生產工藝中的過程真菌污染組成情況及多樣性奠定了技術基礎。

本研究結合傳統微生物學方法和二代高通量測序技術，以工業化豆干的生產流程為采樣順序，研究生產過程中的真菌污染情況，擬明確加工過程中的真菌高風險環節，揭示主要污染真菌群落組成及其在加工過程中的多樣性變化，找出關鍵真菌污染點，為企業降低真菌污染風險，保證產品安全及品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

半成品：豆漿、鹵制前豆干、烘烤后豆干、預包裝豆干，成品：殺菌后豆干，食品接觸表面樣本：包布，在豆漿輸送管壁、豆漿桶內壁、堿處理缸壁、烘烤內壁、烘烤輸送帶、預包裝內壁上取樣的棉簽 四川徽記食品股份有限公司的豆干生產線上；平板計數瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kitomega試劑盒 美國Omega公司；瓊脂糖 西班牙biowest公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen公司；建庫試劑盒NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 美國Bioo Scientific公司；測序試劑盒MiSeq Reagent Kit 美國Illumina公司。

ABI GeneAmp?9700型PCR儀 美國ABI公司；電泳儀DYY-6C 中國北京市六一儀器廠；微型熒光計Quantus? 美國Promega公司；高通量測序儀 Illumina(Miseq) 美國Illumina公司；超凈工作臺SW-CJ-1D 成都宜恒實驗儀器有限公司；電子天平 青島明博環保科技有限公司；恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司。

1.2 豆干的生產工藝

1.2.1 豆干的生產工藝 豆干的生產工藝流程圖見圖1。

圖1 豆干生產工藝流程圖Fig.1 Main manufacturing process of dried soybean curd

1.2.2 工藝要點 大豆浸泡6～12 h后，磨漿過濾，得到豆漿；豆漿煮沸、凝固、脫水、成型、切塊，形成鹵制前豆干；鹵制前豆干穿堿鹵制(pH=10)、烘烤(65～75 ℃)，得到烘烤后豆干；烘烤后豆干包裝形成預包裝豆干，再殺菌(121 ℃，15 min)，得成品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的采集 豆干生產廠房按照GMP和HACCP標準建造。企業車間衛生管理按照GB 14881-2013《食品安全國家標準 食品生產通用衛生規范》實施，車間溫度控制在10 ℃以下。采樣時間：每班生產開始前(每班生產結束后全車間均經過消毒清洗，食品接觸輔助用具采用食用小蘇打溶液巴式殺菌)。包布(商業滅菌后剪刀剪為10 cm2小塊)、鹵制前豆干、烘烤后豆干、預包裝豆干和滅菌前豆干：用無菌鑷子夾取，并立即放入50 mL無菌離心管，于-20 ℃備用，均用于平板計數，其中包布、鹵制前豆干、烘烤后豆干、預包裝豆干同時用于高通量測序；其余食品接觸面樣品：用沾有無菌生理鹽水的棉簽反復摩擦豆漿輸送管壁、豆漿桶內壁、堿處理缸壁、烘烤內壁、烘烤輸送帶、預包裝內壁的表面，涂布每個樣品表面，涂布區域約100 cm2，涂布2～3次，備用于高通量測序。豆漿：用無菌移液器吸取豆漿，注入50 mL無菌離心管中，于-20 ℃備用，用于平板計數。

1.3.2 菌落總數、霉菌和酵母計數 按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》和GB 4789.15-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》測定菌落總數、霉菌和酵母數。無菌操作稱取10 g樣品，切成碎片，放入無菌均質器中，加入90 mL無菌生理鹽水，均質，制成1∶10稀釋液。同樣操作制成10-3～10-6的系列稀釋液。吸取1 mL 10-3～10-6的樣品稀釋液于無菌培養皿中，每皿加入15～20 mL的平板計數瓊脂培養基，混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉，于37 ℃培養2 d，檢測菌落總數。同樣，吸取1 mL 10-3～10-6的樣品稀釋液于無菌培養皿中，每皿加入20～25 mL的孟加拉紅瓊脂培養基，混合均勻。待瓊脂凝固后，正置平板，于28 ℃培養5 d，檢測霉菌和酵母數量。

1.3.3 16S rDNA二代高通量測序法

1.3.3.1 測序樣品 根據菌落計數結果進行選擇，分別選擇了半成品、成品和部分食品接觸面。半成品：鹵制前豆干、烘烤后豆干、預包裝豆干；成品：殺菌后豆干；食品接觸面：豆漿輸送管壁、豆漿桶內壁、包布、堿處理缸壁、烘烤內壁、烘烤輸送帶、預包裝內壁。

1.3.3.2 DNA抽提和PCR擴增 用E.Z.N.A.? soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA)說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop 2000測定DNA濃度、純度；用5’端分別連接樣本特異性8堿基barcode的引物對ITS1F (5’-CTTGGT CATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R (5’-GCTGCG TTCTTCATCGATGC -3’)，對16S rDNA基因ITS1-ITS2可變區進行PCR擴增，擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，27個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩定延伸10 min，最后4 ℃保存。

1.3.3.3 Illumina Miseq測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，根據AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 說明書純化回收產物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantiFluor?-ST (Promega,USA)對回收產物進行檢測定量，建庫并于Illumina MiSeq平臺(Illumina, San Diego, USA)上機測序。

1.3.3.4 數據處理 使用Trimmomatic軟件原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接，overlap需大于10 bp。使用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類[15]；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫(SSU128)，設置比對閾值為70%。

1.4 數據分析

在真菌高通量測序過程中，對10個樣本按最小樣本序列數進行抽平，排除序列數對分析結果的影響。所有試驗至少進行三次。細菌群落組成圖和熱圖用R語言處理；數據使用SPSS 21.0軟件處理；用SPSS進行方差分析(ANOVA)；當P<0.05時具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 確定真菌污染高風險環節

根據豆干加工工藝流程，選取了主要食品接觸表面、半成品(煮沸豆漿、鹵制前豆干、烘烤后豆干、預包裝豆干)、成品(殺菌后豆干)進行菌落總數、霉菌和酵母計數。從圖2可知，除煮沸后豆漿和殺菌后豆干外，豆干在整個生產過程中，霉菌和酵母含量均處于較高水平(2×104～2×105CFU/g)，菌落總數也處于較高的水平(2×103～2×106CFU/g)。上述結果表明煮沸工藝和終端高壓殺菌工藝能顯著降低豆漿中微生物含量；豆干生產中的主要食品接觸面(包布)、加工半成品中存在明顯的真菌性污染；半成品的微生物污染主要來自于煮沸豆漿到預包裝豆干的加工單元。

圖2 豆干加工過程樣品菌落總數、霉菌及酵母計數Fig.2 Total number of colony, count of mold and yeast in dried bean curd

2.2 真菌Alpha多樣性指數分析

為明確豆干加工半成品中的主要真菌污染情況，對豆漿到預包裝豆干的各加工單元食品接觸面樣本及半成品進行真菌多樣性分析，包括：鹵制前加工單元(豆漿輸送管壁—豆漿桶內壁—包布—鹵制前豆干)、鹵制烘烤加工單元(堿處理缸壁—烘烤內壁—烘烤輸送帶—烘烤后豆干)和預包裝加工單元(預包裝內壁—預包裝豆干)。由圖3各樣本稀釋性曲線可知，在真菌高通量測序過程中，每個樣本序列數達52407，測序數目充足。Shannon、Simpson指數表示樣品的菌群多樣性，Shannon指數值越大，Simpson指數值越小，菌群多樣性越高。Ace、chao1指數表示物種的豐富度，其值越高，表示菌群豐度越高。

圖3 16S rDNA高通量測序樣本的稀釋曲線Fig.3 Dilution curves of the samples in 16S rDNA highthroughput gene sequencing

由表1知，在鹵制前加工單元，豆漿輸送管壁具有最高的Shannon值和最低的Simpson值，分別為2.37和0.17，顯示最高的菌群多樣性；豆漿桶內壁的Ace值和Chao1值最高，達78.85和78.00，顯示最高的菌群豐富度。在鹵制烘烤加工單元，烘烤內壁具有最高的Shannon值和較低的Simpson值，分別為2.31和0.28，顯示較高的菌群多樣性；堿處理缸壁的Ace值和Chao1值最高，為87.59和87.44，顯示最高的菌群豐富度。在預包裝加工單元，預包裝內壁的Shannon值，Ace值和Chao1值最高，分別為1.69，164.17和164.92，顯示最高的菌群豐富度和菌群多樣性。上述結果表明，預包裝豆制品在生產過程中存在真菌污染風險；其中，半成品接觸表面的菌群豐富度和菌群多樣性均高于半成品，提示半成品的真菌污染可能來源于其接觸表面。

表1 Alpha多樣性指數表Table 1 Alpha diversity index table

2.3 豆干半成品的真菌群落組成分析

豆干加工半成品的真菌群落組成如圖4所示。柯達酵母屬(Kodamaea)是鹵制前豆干的絕對優勢菌種，占比99.48%。柯達酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)和毛孢子菌屬(Trichosporon)是烘烤后豆干的主要優勢真菌，分別為52.64%、26.56%和7.18%。柯達酵母屬(Kodamaea)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)是預包裝豆干的主要優勢真菌，占比71.45%、15.18%和3.21%。上述結果顯示，柯達酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)為加工半成品中的主要污染真菌。Ezeokoli等[16]在發酵大豆產品中發現了柯達酵母屬(Kodamaea)、Alternaria、曲霉屬(Aspergillus)、念珠菌屬(Candida)等真菌，與本文一致。Xu等[17]報道曲霉屬(Aspergillus)也存在于腐乳發酵過程。其中，曲霉廣泛存在于食品中，如發酵食品、米面干制品等[18-19]。鏈格孢菌主要存在于水果、烘焙食品等[20-21]。

2.4 豆干加工中食品接觸表面的真菌群落組成分析

2.4.1 鹵制前加工單元 鹵制前加工單元環境真菌群落組成如圖5所示。豆漿輸送管壁是豆漿的首個接觸表面，優勢菌是地霉屬(Geotrichum)、毛孢子菌屬(Trichosporon)和棒孢酵母屬(Clavispora)，占比14.6%、9.28%、7.99%。豆漿桶內壁的優勢菌是毛孢子菌屬(Trichosporon)、念珠菌屬(Candida)和隱球 菌 屬(Cutaneotrichosporon)，占 比42.01%、12.26%和8.88%。包布的優勢菌是毛孢子菌屬(Trichosporon)、曲霉屬(Aspergillus)和念珠菌屬(Candida)，占比52.83%、22.66%和7.1%。經熱堿水清洗后的包布和與煮沸豆漿直接接觸的環境表面樣本中檢出毛孢子菌屬(Trichosporon)、曲霉屬(Aspergillus)和念珠菌屬(Candida)等真菌，說明其在85 ℃和弱堿水處理下仍能存活，需要采取更嚴格的清洗消毒策略，以保證輔助用具和食品接觸表面衛生，減少對產品的污染。

2.4.2 鹵制烘烤加工單元 鹵制烘烤加工單元環境真菌群落組成如圖5所示。堿處理缸壁的優勢菌是毛孢子菌屬(Trichosporon)、Apiotrichum和Cutaneotrichosporon，占比28.22%、23.15%、18.13%。烘烤內壁的優勢菌是念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)和枝孢屬(Cladosporium)，占比31.71%、16.0%和10.56%。烘烤輸送帶的優勢菌是囊擔菌屬(Cystobasidiales)和鐮刀霉屬(Fusarium)，占比29.56%、25.59%。鹵制烘烤加工單元為較高溫度高鹽高堿加工單元，具有不利于微生物生長的環境特征[22]，豆干先后通過pH為10的堿處理缸壁和高于70 ℃的烘烤內壁，但依然有部分真菌存活。

2.4.3 預包裝加工單元 預包裝單元加工環境真菌群落組成如圖5所示。念珠菌屬(Candida)、柯達酵母屬(Kodamaea)和毛孢子菌屬(Trichosporon)是預包裝內壁的主要優勢真菌，占比39.27%、31.44%和17.4%。

圖4 半成品真菌群落組成圖Fig.4 Fungi composition in genus level of semi-finished product

圖5 豆干加工過程食品接觸表面樣本和半成品群落組成圖Fig.5 Fungi composition in genus level of the food contact surface samples and semi-finished product

2.5 豆干加工過程中真菌污染溯源分析

真菌群落熱圖和各樣本的優勢屬含量如圖6和表2，基于此，對半成品中的主要污染真菌進行溯源分析。柯達酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)為半成品的主要污染真菌(圖4)。各真菌污染溯源分析如下：

柯達酵母屬(Kodamaea)在三個半成品中均大量存在。由表2可知，柯達酵母屬(Kodamaea)主要在豆漿桶內壁(0.46%)、包布(1.00%)、烘烤內壁(2.46%)和預包裝內壁(31.44%)中檢出，其常見于海水、土壤中，推測其主要污染點為點鹵前和預包裝過程。

念珠菌屬(Candida)是鹵制烘烤加工單元新增加的優勢污染菌，主要在烘烤內壁(31.71%)和預包裝內壁(39.27%)等食品接觸表面檢出，主要污染點為鹵制烘烤環節和預包裝環節。

毛孢子菌屬(Trichosporon)主要存在于烘烤后豆干，此前的主要食品接觸表面是豆漿桶內壁(42.01%)、包布(52.83%)、堿處理缸壁(28.22%)和烘烤內壁(16.00%)，可能由鹵制前車間和鹵制烘烤車間的環境介質和加工人員引入。

鏈格孢屬(Alternaria)廣泛分布于自然界，是食品、工業材料上常見的腐生菌，其在烘烤后豆干中含量較低，主要存在于預包裝豆干，主要食品接觸表面是預包裝內壁(0.49%)，主要由預包裝內壁引入。

曲霉屬(Aspergillus)在烘烤后豆干中含量極低(0.02%)，為預包裝加工單元新增加的優勢污染菌，主要在預包裝內壁(0.29%)檢出。曲霉屬廣泛分布于谷物、空氣中。可能是通過預包裝車間的環境介質引入，附著于預包裝內壁，進一步污染預包裝豆干。

上述結果顯示，半成品中的真菌污染主要由各加工單元環境介質通過食品接觸表面引入：鹵制前加工單元引入柯達酵母屬(Kodamaea)和毛孢子菌屬(Trichosporon)，其高風險接觸表面為豆漿桶內壁和包布。鹵制烘烤加工單元引入念珠菌屬(Candida)和毛孢子菌屬(Trichosporon)，其高風險接觸表面為堿處理缸壁和烘烤內壁。預包裝加工單元引入了鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)，其高風險接觸表面為預包裝內壁。鹵制前加工單元高風險接觸面位于凝固段，該工序與鹵制烘烤段均處于高溫環境，作業溫度在70 ℃以上，沸點以下，堿處理缸壁還間歇性浸泡在pH10的堿性環境中，在上述食品接觸表面檢出真菌，提示食品組成成分可能對真菌的環境耐受力存在影響，尚待進一步研究。

圖6 豆干加工半成品及其接觸表面樣本真菌熱圖Fig.6 Fungi heatmap in genus level of the semi-finished product and the food contact surface samples

表2 高通量測序分析檢測到每個樣本的優勢屬Table 2 The dominant genera in each sample detected by High-throughput sequencing analysis

2.6 真菌污染對豆干產品安全性及貨架期影響分析

高壓滅菌后的豆干經過37 ℃培養14 d后，進行平板計數和真菌多樣性檢測。結果顯示，菌落總數、霉菌和酵母計數低于10 CFU/g，樣品PCR擴增產物(引物ITS1F-ITS2R)的條帶亮度極弱，說明真菌核酸提取初始濃度極低。在暫儲和車間控溫條件下(10 ℃)，殺菌前產品霉菌和酵母總數可控制在105CFU/g以下(圖2)，在該初始菌落數條件下，高溫高壓滅菌可殺滅絕大多數真菌，消除真菌污染可能導致的產品腐敗風險，表明在本文所述加工及殺菌條件下，真菌性污染不是導致豆干貨架期腐敗的主要原因。

柯達酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)是加工過程中主要優勢菌屬，其部分菌種可分產生真菌毒素。念珠菌屬中的白念珠菌可分泌細胞外酸性蛋白酶、磷脂酶等，增強粘附，從而造成皮膚病變和系統性感染[23]；鏈格孢屬會產生騰毒素、鏈格孢菌酚、交鏈孢酚單甲醚等毒素，具有遺傳毒性和致突變性[24]；曲霉屬中的黃曲霉、赭曲霉、雜色曲霉、部分黑曲霉等在可產生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、雜色曲霉素等真菌毒素[25]。真菌毒素的產生與環境條件密切相關，成品中真菌毒素殘留風險仍待進一步研究。通常在25～33 ℃、相對濕度85%～95%時，真菌生長繁殖較快且易形成真菌毒素；豆干加工過程中，蒸煮單元顯著提高車間溫濕度，在非控溫條件下，可能存在更大的真菌污染風險和毒素積累風險。因此，改善管路、加工輔助材料的清洗消毒程序，并控制加工過程溫濕度，有利于降低豆干加工過程的真菌毒素污染風險。

3 結論

結合傳統微生物學方法和二代高通量測序技術，研究了工業化預包裝豆干生產過程及半成品的真菌性污染風險。研究發現，按照GB 14881-2013《食品安全國家標準 食品生產通用衛生規范》嚴格執行車間衛生管理，且實行車間控溫條件下，豆干生產線仍存在真菌污染風險。豆漿桶內壁、包布、堿處理缸壁、烘烤內壁和預包裝內壁為高風險接觸表面；柯達酵母屬(Kodamaea)、念珠菌屬(Candida)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、鏈格孢屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)為主要污染真菌。盡管真菌污染不是導致高壓滅菌后成品豆干貨架期腐敗的主要原因，仍應控制加工過程溫濕度，并在保證無毒、低殘留的基礎上，采取更嚴格的管路、加工輔助材料清洗消毒程序，以便降低豆干工業化生產過程中的真菌及真菌毒素污染風險，提高食品安全。