甲烷氧化菌素-銅配合物模擬過氧化物酶檢測面粉中的過氧化鈣

張嘉鈺，辛嘉英,, ，劉豐源，夏春谷，許錫凱，王廣交，崔添玉

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實驗室，黑龍江哈爾濱 150076；2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點(diǎn)實驗室，甘肅蘭州 730000)

過氧化鈣(CaO2)又稱二氧化鈣，是一種白色或淡黃色粉末，難溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，是一種新型的多功能無機(jī)精細(xì)化工產(chǎn)品，目前開發(fā)和應(yīng)用較為廣泛[1]。CaO2對紫外線有吸收作用，可脫色、增氧、殺菌、防腐，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在環(huán)境保護(hù)、冶金工業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及食品加工中。在食品加工中一般用作殺菌劑、漂白劑、防腐劑等[2-3]。CaO2作為面粉添加劑，可以改善面粉的色澤并且加快后熟，也可作為面粉增筋劑和面包改良劑等，能代替過氧化苯甲酰，曾被列入使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[4]。但經(jīng)長期研究表明，使用過量的CaO2會對身體造成損害，如刺激腸道、誘發(fā)癌癥等，極性毒性LD50(大鼠經(jīng)口)大于5000 mg/kg[5]。在2011年3月1日，衛(wèi)生部等7部聯(lián)合發(fā)布全面禁止過氧化苯甲酰、過氧化鈣兩種面粉增白劑的使用[6]。但為了提高利益，仍有大量不良商家向面粉中非法添加CaO2，對人們的健康造成極大影響。目前，國內(nèi)外關(guān)于面粉中CaO2的檢測資料較少，開發(fā)新型的檢測方法意義重大。

目前，對于CaO2的檢測有熱分解法、乙二胺四乙酸滴定法(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、間接碘量法、高錳酸鉀法等[7-10]，但這些方法只適用于對CaO2純品的檢測，并且滴定的速度難以控制，準(zhǔn)確度過低，不能實現(xiàn)對CaO2的痕量檢測。過氧化物酶(Peroxidase，POD)可通過過氧化氫催化多種有機(jī)化合物的氧化，并且可以產(chǎn)生顏色變化，已經(jīng)廣泛的用于對過氧化氫的酶法測定[11-12]。張玉榮等[2]提出了酶催化法測定小麥粉中的過氧化鈣，所采用的過氧化物酶是辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)，然后利用CaO2與酸反應(yīng)可生成過氧化氫(H2O2)，再以碘化鉀(KI)為增敏劑，可使季胺(4，4’-二甲氨基-二苯基甲烷)氧化顯色，成功實現(xiàn)了對面粉中CaO2定性定量的分析。HRP已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于檢測H2O2[13-14]，但HRP為天然酶，它存在一些嚴(yán)重的缺點(diǎn)，它的催化活性易受溫度和pH影響，并且它的制備和純化非常繁瑣耗時，價格昂貴，在實際應(yīng)用中難以推廣。為了克服這些局限性，學(xué)者們在探索模擬酶取代天然過氧化物酶的研究中做了大量的工作[15]，甲烷氧化菌是一類利用甲烷作為唯一能源和碳源的細(xì)菌[16]，甲烷氧化菌素(Mb)是甲烷氧化菌向周圍環(huán)境中釋放的一種銅捕獲小肽，與銅離子結(jié)合時具有高親和力和特異性[17-19]。目前文獻(xiàn)報導(dǎo)的Mb具有能與銅配位的五元雜環(huán)尾基和含有巰基或二硫鍵的頭基[20-21]，且配位后具有POD的活性。此外，相較于其他模擬酶Mb具有可以忽略不計的毒性，具有良好實用價值[22]。Xin等[23]研究了Mb-Cu不同配位方式對催化速度的影響，結(jié)果表明該配合物符合生物催化劑的一般規(guī)律，且比天然酶催化劑穩(wěn)定性更高，Mb2-Cu配位形式具有最高的催化能力。

本研究建立和優(yōu)化小麥粉中過氧化鈣的酶-分光光度法，利用CaO2與酸反應(yīng)生成過氧化氫(H2O2)，在模擬酶Mb-Cu存在的條件下，催化氧化對苯二酚(Hydroquinone，HQ)生成對苯二醌，從而用分光光度法進(jìn)行檢測，以期實現(xiàn)定性定量的分析，具體反應(yīng)的方程式如下：

可用于對面粉中CaO2的痕量檢測，為食品監(jiān)督單位提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲基彎菌OB3b 清華大學(xué)贈送；甲烷 99.99%，哈爾濱黎明氣體有限公司；甲醇 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇 分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司；硝酸鹽培養(yǎng)基 參照文獻(xiàn)[24]制備；大孔樹脂 美國Supelco公司；五水合硫酸銅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 分析純，天津天力化學(xué)試劑有限公司；過氧化鈣 70%，美國Alfa Aesar公司；對苯二酚 分析純，Aladdin化學(xué)試劑公司；濃硫酸 分析純，北京化學(xué)試劑公司；市售面粉 購自當(dāng)?shù)爻校粚嶒炗盟?均為二級水。

UV-2550型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；FDU-1200型冷凍干燥機(jī) 東京理化器械公司；2-16 K型高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；HL-2S型恒流泵 上海滬西分析儀器廠；組合式紫外檢測器 上海金達(dá)公司；5BG型生化發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備公司；RV8V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甲烷氧化菌素的分離與純化 參照文獻(xiàn)[23]的方法，使用甲基彎菌(Methylosinus trichosporium OB3b)為菌種，在NMS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d，得到的發(fā)酵液用離心機(jī)(4 ℃，8000 r/min)離心20 min，得到的上清液經(jīng)活化后的Diaion HP-20大孔樹脂的吸附，再用甲醇洗脫，從而得到Mb，通過30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，再經(jīng)過冷凍干燥得到粉末狀Mb粗品放入-30 ℃冰箱中備用。

1.2.2 Mb-Cu的制備 將上述粉末狀Mb配制成濃度為5×10-4mol/L的溶液放入比色皿中，在紫外分光光度計的監(jiān)測下，使用5 μL微量進(jìn)樣器向比色皿中每隔10 min加入2 μL濃度為5 mmol/L的Cu(Ⅱ)，觀察390 nm處的峰，直至峰值不再下降為止，得到Mb-Cu待用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取一定量過氧化鈣，配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再加入10 mL濃度為1%的稀硫酸，渦旋混勻5 min，得到標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

擬酶溶液的配制：取一只100 mL容量瓶，依次加入Mb-Cu和對苯二酚，用磷酸緩沖溶液進(jìn)行定容，使Mb-Cu的濃度為3.9×10-6mol/L，對苯二酚的濃度為5×10-4mol/L，上下?lián)u動，使其溶解，放入冰箱冷藏備用。

在標(biāo)準(zhǔn)工作液中分別取0.00、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，放入50 mL比色管中，再分別加入10 mL擬酶溶液，加水至刻度線，60 ℃恒溫水浴3 min，以過氧化鈣濃度為X軸，以288 nm處的吸光度下降值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 樣品的測定 準(zhǔn)確稱取1 g面粉，加入10 mL 1%的稀硫酸，渦旋混勻后，加水定容至100 mL，搖勻后轉(zhuǎn)入離心管，以8000 r/min離心5 min，吸取上清液40 mL，再加10 mL擬酶溶液，測定288 nm處吸光度，再于60 ℃恒溫水浴3 min，288 nm處測定吸光度，計算前后差值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比讀出過氧化鈣的含量。以無添加過氧化鈣的小麥粉作為空白樣品。

1.2.5 實驗條件的選擇 討論了Mb-Cu用量、溫度、pH、反應(yīng)時間對過氧化氫和對苯二酚反應(yīng)速度的影響。

1.2.5.1 Mb-Cu用量對過氧化氫和對苯二酚反應(yīng)速度的影響 取10 mL的玻璃小瓶五只，將粉末狀Mb-Cu配制成各種濃度，使其在擬酶試劑中的濃度 分 別 為0.0×10-6、1.3×10-6、2.6×10-6，3.9×10-6、5.2×10-6、6.5×10-6mol/L的溶液，再加入與擬酶試劑等量的過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)工作液，觀察288 nm處吸光度的下降速度，檢驗Mb-Cu的濃度對過氧化氫和對苯二酚反應(yīng)速度的影響。

1.2.5.2 溫度對過氧化氫和對苯二酚反應(yīng)速度的影響 取五只離心管，每只加入等量過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)工作液與擬酶試劑溶液，分別在30 、40、50、60、70 ℃的反應(yīng)溫度下反應(yīng)3 min后，測量288 nm處的吸光度的下降值，考察溫度在30～70 ℃之間對反應(yīng)速度的影響。

1.2.5.3 pH對過氧化氫和對苯二酚反應(yīng)速度的影響 分別試驗pH在1～5時對實驗反應(yīng)速度的影響，采用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH。取五只10 mL的玻璃小瓶，分別加入等量的過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)工作液與擬酶試劑溶液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，放入60 ℃水浴鍋中水浴3 min后，于288 nm測定吸光度，計算反應(yīng)速度。

1.2.5.4 反應(yīng)時間對過氧化氫和對苯二酚反應(yīng)速度的影響 取12只離心管，分別加入2mL過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)工作液與2 mL擬酶試劑溶液，采用最佳反應(yīng)溫度(60 ℃)，在反應(yīng)時間分別為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220 s時測量288 nm處的吸光度，探究反應(yīng)時間對反應(yīng)體系的影響。

1.2.6 對過氧化氫和對苯二酚反應(yīng)速度的測定 反應(yīng)速度計算公式如下：

式中：v 為 過氧化氫和對苯二酚的反應(yīng)速度(mol/L·s)；c1為對苯二酚初始濃度(mol/L)；c2為對苯二酚剩余濃度(mol/L)；t 為反應(yīng)時間(s)。

1.2.7 精密度和準(zhǔn)確度的測定 采用沒有添加過氧化鈣的面粉，稱取1 g并在其中分別加入不同量(200、400、600 μg/g)的過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)品，按照步驟

1.2.4進(jìn)行實驗，每一個濃度水平做4組每組6次的平行實驗，計算得出精密度和準(zhǔn)確度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復(fù)4次，采用Origin 8.0和SPSS13.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mb-Cu的結(jié)合

Mb-Cu的結(jié)合過程如圖1，由曲線可以觀察查到，隨著Cu(Ⅱ)的不斷加入，通過紫外-可見分光光度計的監(jiān)測可以發(fā)現(xiàn)，在340 nm和390 nm處的吸收峰逐漸下降，由文獻(xiàn) [23] 可知這說明Cu(Ⅱ)分別與Mb中的4 -羥基- 5 -硫酰咪唑(HTI)和4-硫酰- 5 -羥基咪唑(THI)發(fā)生結(jié)合，390 nm處吸收峰的下降表明Cu(Ⅱ)與THI中的S發(fā)生配位；340 nm處吸收峰變化表明Cu(Ⅱ)與HTI基團(tuán)中的S發(fā)生了配位。直到340 nm和390 nm處的吸收峰不再下降，配位結(jié)束，Mb與Cu結(jié)合為Mb-Cu。

圖1 Mb-Cu配位的紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectrum of Mb-Cu complex

2.2 檢測波長的選擇

CaO2與酸反應(yīng)可生成H2O2，利用Mb-Cu模擬酶催化H2O2氧化對苯二酚生成對苯二醌并伴有輕微顏色變化，反應(yīng)機(jī)理如圖2所示。

圖2 Mb-Cu催化反應(yīng)機(jī)理Fig.2 Mb-Cu catalytic reaction mechanism

取3只50 mL比色管，分別加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL的過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)工作液，再加入10 mL的模擬酶試劑溶液，定容后于60 ℃水浴鍋水浴3 min后進(jìn)行全光譜掃描，測定結(jié)果如圖3。由圖3可知，隨著過氧化鈣濃度的升高，245 nm處吸收峰逐漸升高，288 nm處吸收峰逐漸下降。由文獻(xiàn)[25]可知，245 nm處的吸收峰為產(chǎn)物對苯二醌的吸收峰，288 nm處為對苯二酚的吸收峰，可利用對苯二酚的消耗量得出過氧化鈣的含量，所以，將采用288 nm為測定波長。

圖3 不同CaO2含量下的紫外-可見吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet-visible absorption spectra at different CaO2 concentrations

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 Mb-Cu用量的影響 在Mb-Cu濃度在10-6mol/L的條件下[23]，將粉末狀Mb-Cu配制成各種濃度，使其在擬酶試劑中的濃度分別為0.0×10-6、1.3×10-6、2.6×10-6、3.9×10-6、5.2×10-6、6.5×10-6mol/L的溶液，檢驗Mb-Cu的濃度對過氧化氫和對苯二酚反應(yīng)速度的影響，結(jié)果如圖4，當(dāng)Mb-Cu濃度在0～3.9×10-6mol/L時，由于模擬酶濃度增加，催化效果增強(qiáng)，所以反應(yīng)速度隨著Mb-Cu濃度的增加而增大，當(dāng)濃度超過3.9×10-6mol/L時，反應(yīng)速度增加緩慢，催化效果達(dá)到頂峰，所以采用Mb-Cu的濃度為3.9×10-6mol/L。

圖4 Mb-Cu濃度對反應(yīng)速度的影響Fig.4 Effect of Mb-Cu concentration on reaction rate

2.3.2 溫度對反應(yīng)速度的影響 一般所使用的過氧化物酶為辣根過氧化物酶，是天然酶，酶是一種蛋白質(zhì)，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等外界條件會對催化速度產(chǎn)生巨大影響，一般的催化條件為常溫、常壓、pH在5.0～8.0之間[26]。而模擬酶可通過提高溫度來提高反應(yīng)速度。

取五只離心管，分別加入等量過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)工作液與擬酶試劑溶液，反應(yīng)時間為5 min，考察溫度在30～70 ℃之間對反應(yīng)速度的影響，結(jié)果如圖5，圖5的曲線表明該反應(yīng)的反應(yīng)速度隨溫度的升高而上升，在60 ℃時，反應(yīng)速率增加最快，60 ℃后，反應(yīng)速度依然上升，但上升趨勢不明顯，且溫度過高M(jìn)b-Cu可能發(fā)生部分變性，最終導(dǎo)致失活，高溫也易發(fā)生副反應(yīng)，所以，實驗選擇的反應(yīng)溫度為60 ℃。

圖5 溫度對反應(yīng)速度的影響Fig.5 Effect of temperature on reaction speed

2.3.3 pH對反應(yīng)速度的影響 pH會影響反應(yīng)物表面的離子狀態(tài)。通常情況下，天然過氧化物酶最佳反應(yīng)pH在5.0～8.0之間，過高或過低都會使其失活[26]。分別試驗pH在1～5時對實驗反應(yīng)速度的影響，采用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，在過氧化鈣濃度一定，反應(yīng)溫度為60 ℃時，反應(yīng)3 min，結(jié)果如圖6所示，由圖6可知，反應(yīng)速度隨著pH的升高略有下降，但從整體來看，pH對實驗反應(yīng)速度影響不大，證明甲烷氧化菌素模擬酶對pH環(huán)境要求不高，在pH在1～5時仍保持活性，可省略實驗中用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH的步驟，相對于天然酶檢測來說，模擬酶的催化簡化了實驗過程。

圖6 pH對反應(yīng)速度的影響Fig.6 Effect of pH on reaction speed

2.3.4 反應(yīng)時間對反應(yīng)體系的影響 在過氧化鈣濃度和酶用量一定時，采用最佳反應(yīng)溫度(60 ℃)，在0～220 s中選取12個時間點(diǎn)來探究反應(yīng)時間對對應(yīng)體系的影響，結(jié)果如圖7，可以看出，0～180 s時，288 nm處的吸光度下降較快，180 s后吸光度下降速度減慢，以后幾乎不變，說明已經(jīng)反應(yīng)完全，所以選擇180 s作為反應(yīng)時間。

圖7 反應(yīng)時間對反應(yīng)速度的影響Fig.7 Effect of reaction time on reaction speed

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 當(dāng)反應(yīng)條件為Mb-Cu濃度為3.9×10-6mol/L、反應(yīng)溫度為60 ℃、反應(yīng)時間為180 s時，按梯度吸取過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)工作液于比色管中，按照1.2.3的操作步驟進(jìn)行，得到如圖8的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明該體系在吸光度A288的值與過氧化鈣濃度在0.0～8.0 mg/L之間存在線性關(guān)系，決定系數(shù)R2為0.99281。對空白面粉做11組平行實驗，通過計算，可得出標(biāo)準(zhǔn)偏差S=6.49×10-4，從而根據(jù)三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差與斜率之比，得出檢出限(LOD)為1.82×10-2mg/L。

圖8 CaO2的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 CaO2 standard curve

2.3.6 精密度和準(zhǔn)確度 采用沒有添加過氧化鈣的面粉，稱取1 g并在其中分別加入不同量(200、400、600 μg/g)的過氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)品，按照步驟1.2.4進(jìn)行實驗，每一個濃度水平做4組每組6次的平行實驗，結(jié)果如表1。其平均加標(biāo)回收率為98.2%～100.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.49%～1.32%，表明本方法用于檢測面粉中的過氧化鈣具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

表1 加標(biāo)回收結(jié)果(n=6)Table 1 Results of spike recovery (n=6)

3 結(jié)論

本文利用CaO2與酸反應(yīng)生成過氧化氫的原理，采用Mb-Cu配合物模擬過氧化物酶催化過氧化氫氧化對苯二酚，建立了一種面粉中過氧化鈣的定量檢測方法。酸堿度調(diào)節(jié)的實驗結(jié)果表明，Mb-Cu模擬酶與天然過氧化物酶不同，pH在檢測中對反應(yīng)速度的影響可忽略不計，不易受環(huán)境酸堿度的影響，從而省去了傳統(tǒng)過氧化物酶法需要調(diào)節(jié)pH的操作步驟，由此降低了檢測時間，提高了檢測效率。此外對其他條件進(jìn)行了優(yōu)化，成功實現(xiàn)了對面粉中CaO2快速、準(zhǔn)確的測量，此方法抗干擾能力強(qiáng)，操作步驟簡單，可用于對實際樣品的分析。