富含麥角硫因的金針菇提取物對冷凍豬肉糜品質的影響

陶 冶，肖 珊, ，蔡嘉銘，王際輝，劉冰南，王 亮

(1.大連工業大學生物工程學院，遼寧大連 116034；2.東莞理工學院化學工程與能源技術學院，廣東東莞 523808)

肉糜類產品因其方便快捷，營養可口，深受消費者的喜愛[1]，但肉糜在制作和儲存過程中極易受到光、熱、氧氣等環境因素的影響，發生氧化酸敗，從而導致肉的品質下降，縮短了貨架期[2]。雖然低溫冷凍貯藏是一種可以保證其品質的一種手段，但隨著貯藏時間的延長，肉糜的品質也會下降，可以通過添加抗氧化劑來保持肉糜的品質。常用的化學抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)和叔丁基對苯二酚(TBHQ)，雖然抗氧化效果良好，但是它們的安全性一直是消費者關心的問題[3]，選用天然抗氧化劑作為添加劑是未來延長肉類貨架期的方向。

麥角硫因(L-ergothioneine，EGT)是一種天然的抗氧化劑，主要存在于食用菌中[4]，因其具有較強的抗氧化、清除自由基和螯合金屬離子等功能，而被越來越多人關注[5]。金針菇(Flammulina velutipes)作為食用菌，含有豐富的麥角硫因(含量為0.15～7.27 mg/g干重)，研究發現金針菇提取物在抑制蝦[6]、螃蟹[7]的黑變病以及三文魚[8]的顏色保護中發揮了重要作用，但是其對肉及肉制品的品質影響還不明晰，因而本文將金針菇提取物作為添加劑應用到冷凍肉糜中，探究其對于肉類品質尤其是抗氧化起作用，為金針菇的深加工以及天然抗氧化劑的開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬肉(肥瘦比2∶8) 于大商新瑪特購買；金針菇 購自大連美林園菜市場，真空冷凍干燥后-20 ℃保藏；1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP) Sigmaaldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA) 天津科密歐試劑公司；焦磷酸鈉、鹽酸胍、磷酸二氫鉀、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、乙酸乙酯(分析純) 國藥化學試劑有限公司；鹽酸、乙醇(分析純) 北京化工廠。

SC21CL冷凍干燥機 北京博世康實驗儀器有限公司；RE-524旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；H2050R-1高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；DK-S24恒溫水浴鍋 上海森信實驗設備有限公司；U-5100紫外分光光度計 日本HITACHI公司；V1S000漩渦混勻器 德國IKA公司；E2695-2998 PAD高效液相色譜儀 沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金針菇提取物的制備 參考莫宇麗等[9]的方法并略加修改，制備富含麥角硫因的金針菇提取物。取10 g冷凍干燥后的金針菇粉，按照料液比(1∶60)加入70%的食品級乙醇，混勻，于53 ℃水浴20 min，取出后離心(4 ℃，11000×g，10 min)并收集上清液；恒溫40 ℃旋轉蒸發減壓蒸餾至原體積的1/5，向濃縮液中緩慢加入4倍體積的95%食品級乙醇，靜置過夜；離心取上清(4 ℃，11000×g，10 min)，再次減壓蒸餾至最小體積得到金針菇醇提物1 g。通過高效液相色譜測定醇提物中麥角硫因含量，具體步驟為，將1 g醇提物溶于100 mL純凈水，制作麥角硫因標準曲線(40、80、120、160、200 mg/L)；色譜條件：色譜柱∶Hilic(250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)；流動相為乙腈∶水=97∶3；流速1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。根據標準曲線和樣品的峰面積來計算麥角硫因含量，最終測得麥角硫因含量為(15.29±0.52) mg/g。

1.2.2 肉糜的制備 將購買的肥肉與瘦肉洗凈，剔除結締組織。取豬肉1 kg(肥瘦比2∶8)，絞肉機攪碎后加入6 g金針菇提取物(麥角硫因含量為91.74 mg，6 g/kg金針菇提取物DPPH清除率與0.02%的BHA相當，并且對肉糜色澤無影響，因此選用該濃度)混合均勻，此組設為提取物組。空白組取1 kg豬肉(肥瘦比2∶8)，絞肉機攪碎后加入相同質量的純凈水。將每組豬肉樣品分成20份，每份制成50 g餅狀肉糜，真空包裝后于-20 ℃冷凍貯存，分別在0、1、4、8、12周測定各項指標。

1.2.3 pH的測定 按照GB 5009.237-2016《食品pH值的測定》規定的方法進行測定[10]，準確稱取3 g豬肉糜，加入 30 mL蒸餾水，勻漿1 min后，離心(4 ℃，11000×g，5 min)取上清液，測定其pH。

1.2.4 脂肪氧化程度的測定(TBARS) 參考Marcos等[11]方法。稱取肉樣2.5 g，加入20 mL超純水，4 ℃條件下勻漿(13500 r/min，30 s)；取5 mL預冷的25%的TCA加入均質液，4 ℃條件下攪拌15 min；將攪拌后的均質液離心(4 ℃，11000×g，15 min)，取上清液3.5 mL，加入1.5 mL 0.6%TBA溶液，在(70±2) ℃條件下水浴30 min，冷卻后532 nm處測定吸光度。2.5 mL超純水加入1.5 mL的25%TCA和1 mL的0.6%TBA作為空白對照。通過標準曲線計算得到樣品中的丙二醛含量，標準曲線由1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP)標準溶液制作：分別在10 mL加熱管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、2.5 mL的1 mg/L的TEP標準溶液，分別加入1 mL 25%TCA和1.5 mL 0.6%的TBA溶液，(70±2)℃條件下水浴30 min，冷卻后532 nm處測定吸光度。

1.2.5 蛋白氧化程度的測定

1.2.5.1 蛋白質含量的測定 參照Park等[12]的方法，提取肌原纖維蛋白。稱取肉樣2 g，加入10 mL提 取 緩 沖 液(0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L K2HPO4，pH=7.0)，勻漿后離心(2000×g，10 min，4 ℃)，重復四次。在第四次離心前將混合物用四層紗布過濾后調pH至6.0，最后得到的蛋白膏保存于冰盒中備用，以牛血清白蛋白作為標準蛋白，用考馬斯亮藍法測定肌原纖維蛋白濃度(c)：配制蛋白標準溶液10 mg/mL，吸取蛋白質標準品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL置于10 mL的具塞試管中，各管加水至1 mL，加入G-250考馬斯亮藍溶液(G-250含量0.01%，乙醇含量4.7%，磷酸含量為8.5%)4 mL，混勻，放置10 min于595 nm波長處測定吸光度。取樣品0.5 mL加入考馬斯亮藍G-250溶液，反應10 min于595 nm波長處測定吸光度。

1.2.5.2 羰基含量的測定 參考Lund等[13]方法，稱取0.5 g肉樣，加入5 mL焦磷酸鹽緩沖液(2.0 mmol/L Na4P2O7，10 mmol/L Triz-馬來酸鹽，100 mmol/L KCl，2.0 mmol/L MgCl2，2.0 mmol/L EGTA，pH=7.4)4 ℃條件下，充分勻漿。分別取1 mL均質液置于兩個離心管中，加入1 mL 20%TCA，離心15 min(4 ℃，12000×g)后，倒掉上清液，一份加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼(DNPH，其溶解液為2 mol/L HCl)，另一份加入等體積2 mol/L HCl作為空白對照，兩個離心管在黑暗中孵育30 min，每3 min渦旋振蕩10 s。孵育完成后分別加入1 mL 20%TCA沉淀蛋白質，并在12000×g離心15 min。收集下層樣品，并加入2.5 mL濃度為10 mmol/L HCl(溶解液為乙醇-乙酸乙酯=1∶1，V/V)溶液洗滌三次(12000×g，15 min)，去掉樣品中的DNPH。洗滌完成后，下層樣品加入1 mL 6.0 mmol/L鹽酸胍(溶解液為20 mmol/L KH2PHO4，pH=2.3)4 ℃過夜，370 nm測定吸光度，用樣品的吸光度減去相應空白的吸光度。參考Levine等[14]方法，蛋白質羰基衍生物的含量(nmol·mg-1)依據蛋白質的吸光系數22000 L/(mol·cm)計算。

羰基含量(nmol/mg 蛋白質)=(A1-A0)/0.022c

式中：A1為樣品吸光度；A2為空白吸光度；c為蛋白濃度。

1.2.6 鮮度物質的測定

1.2.6.1 核苷酸標準溶液的配制 分別準確稱取肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、單磷酸腺苷(AMP)、次黃嘌呤核苷(HxR)和次黃嘌呤(Hx)標準品10 mg，用超純水溶解混合后定容10 mL容量瓶中。上機前用0.22 μm的微孔濾膜過濾。

1.2.6.2 樣品處理 微凍狀態下稱取樣品5 g，加入15 mL 6%(v/v)冷高氯酸，勻漿后離心(4 ℃，1000×g，20 min)，取上清液，用1 mol/L KOH調節pH至6.5，沉淀重復提取一次，合并上清液并用流動相定容至50 mL。于4 ℃靜置30 min，上機前用0.22 μm的微孔濾膜過濾。

1.2.6.3 色譜條件 應用液相色譜測定不同貯藏時間樣品的核苷酸。色譜柱：Symmetry C18Column柱(150 mm×3.9 mm，粒徑3.5 μm)；流動相：A(pH6.5，0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4)：B(色譜級甲醇)=9∶1；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。依照標準溶液出峰時間來定性分析樣品中各核苷酸物質，依照各物質占總色譜面積的百分比來計算各物質含量。

1.2.7 感官評價 參考趙改名等[15]方法，并做適當修改。選20個小組成員(由10名女性和10名男性組成)，并按照Carpenter等[16]所述的標準進行了培訓。對第0、1、4、8、12周不同處理組的冷凍豬肉糜感官質量進行評價。進行感官評價前將肉糜沸水煮8～10 min，直到肉糜中心溫度達到70±2 ℃，開始進行評定。評價人員通過其視覺、觸覺、嗅覺和味覺來評價肉糜的色澤、風味、嫩度、滋味和整體可接受性，進行綜合評分，并舍去最高值和最低值取其平均值。評分標準見表1。

表1 豬肉糜的感官評分標準Table 1 Standard of sensory evaluation of minced pork

1.3 數據處理

每個樣品重復測定3次，使用Excel統計數據，結果表示為平均值±標準偏差，用Origin 2017繪圖，用SPSS 20.0系統計算方差，并用Duncan’s多重比較法進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 金針菇提取物對冷凍肉糜pH的影響

由圖1可知，隨著冷凍時間的延長，兩個處理組的pH都呈上升趨勢。冷凍0周對照組和提取物組pH變化差異并不顯著，而提取物組的pH變化在隨后的1、4、8、12周均顯著(P<0.05)低于對照組。pH上升的原因可能是由于肉發生自溶和內源性氧化酶的作用，導致脂肪和蛋白質發生分解，生成了胺、氨類物質和其他小分子物質[17]，使得pH不斷升高。加入提取物后肉糜pH顯著(P<0.05)低于對照組，可能是由于金針菇提取物豐富的麥角硫因起到了抗氧化的作用，該結果與添加天然酮類提取物可抑制肉糜pH升高的結果一致[1,17]。以上結果表明，金針菇提取物中的麥角硫因可能通過與內源性氧化酶發生反應[18]，阻止肉的自溶，從而有效地抑制pH的上升，減緩肉糜蛋白質的分解以及營養物質的流失，延長了肉糜的貨架期。

圖1 不同冷凍時間對照組和提取物組冷凍肉糜的pH變化Fig.1 The pH change of minced meat in control and extract groups at different frozen stages

2.2 金針菇提取物對冷凍肉糜脂肪氧化的影響

由圖2可以看出，在貯藏期的第0、1、4、8、12周提取物組的TBARS值分別顯著(P<0.05)低于對照組30.16%、28.17%、29.76%、19.78%和25.44%，表明添加金針菇提取物可以有效地抑制TBARS值的上升。在冷凍貯藏過程中，肉糜TBARS值升高，可能是自由基的產生[19]及不飽和脂肪酸在冷凍期間發生緩慢的氧化引起的[20]。很多研究已證明麥角硫因是出色的抗氧化劑[21-24]，對于H2O2、·OH、1O2、脂質過氧化物、一氧化氮衍生物、超氧離子自由基等有良好的清除效果[25]，Pahila等[8]和Jiang等[26]也驗證了金針菇提取物中的麥角硫因和其他活性物質(例如酚類、類黃酮等)能與內源酶反應，抑制脂肪氧化的發生，從而達到較好的抗氧化效果，延長肉類的貨架期。提取物組脂肪氧化程度的降低在很大程度上要歸功于金針菇提取物中豐富的麥角硫因。由此可見，添加金針菇提取物可以有效地抑制脂肪氧化。本文的研究結果與Ba等[27]的研究結果相一致。

圖2 不同冷凍時間對照組和提取物組冷凍肉糜的脂肪氧化程度Fig.2 The lipid oxidation of minced meat in control and extract groups at different frozen stages

2.3 金針菇提取物對冷凍肉糜蛋白氧化的影響

蛋白質氧化也會對肉類品質產生負面的影響[28]，降低肉類產品的營養價值。羰基化合物的生成是蛋白質氧化的主要產物之一，常用羰基化合物的含量來衡量蛋白質的氧化程度。由圖3可知，在不同的貯藏時間點，提取物組的羰基含量均顯著(P<0.05)低于對照組，表明添加金針菇提取物可以有效地抑制羰基化合物的生成，從而抑制蛋白氧化的發生。在冷凍0、1、4、8、12周時，對比空白對照組，提取物組的蛋白質氧化分別降低了17.72%、29.09%、22.70%、19.92%和21.11%，該結果與脂肪氧化結果相一致。在肉類系統中含有多種過渡金屬離子，如：Fe3+、Cu2+、Ca2+及Al3+等是自由基形成的催化劑[29]，過量的金屬離子會導致蛋白和脂肪的氧化性損傷，破壞肉品中蛋白質的結構[30]，產生大量的羰基化合物，在很大程度上降低肉品的營養價值。提取物中豐富的麥角硫因具有出色的螯合金屬離子能力，朱本占[31]證明了它可以結合這些金屬離子形成絡合物，其中與銅離子的結合能力最強，能有效地抑制由金屬離子介導的蛋白質氧化，從而減少羰基化合物的產生，這也與本實驗結果一致。蛋白質氧化除了產生羰基化合物，還會導致巰基的流失，以及蛋白質的交聯，從而降低了蛋白質的消化率[32]，而麥角硫因含有的巰基可以保護肉糜蛋白的巰基，維持蛋白質結構的穩定。

圖3 不同冷凍時間對照組和提取物組冷凍肉糜的蛋白氧化程度Fig.3 The protein oxidation of minced meat in control and extract groups at different frozen stages

2.4 金針菇提取物對冷凍肉糜鮮度的影響

呈鮮味核苷酸可促進肉類滋味和風味的形成[33]。在呈味核苷酸中，ATP(三磷酸腺苷)的降解產物IMP(肌苷酸)是重要的鮮味物質[34]，而HxR(肌苷)和Hx(次黃嘌呤)是苦味物質，是肉品品質惡化的重要指標。ATP(三磷酸腺苷)的分解途徑主要遵循以下途徑：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx。因此，可以通過測定核苷酸含量來評定肉品的鮮度。

由表2可知，隨著冷凍時間的延長，IMP、ATP、ADP含量均呈下降趨勢，AMP、HxR、Hx含量均呈上升趨勢。在冷凍貯藏的第0、1、4、8、12周，提取物組的IMP含量均顯著(P<0.05)高于對照組0.99%、0.44%、1.15%、1.31%和1.43%，提取物組的Hx顯著(P<0.05)低于對照組0.14%、0.51%、1.1%、0.75%、0.69%；在冷凍貯藏的第0、1、8、12周，提取物組的HxR含量顯著(P<0.05)低于對照組0.82%、0.63%、0.79%和0.82%。這可能是由于金針菇提取物中含有許多核苷酸和游離氨基酸[35]，降低了IMP和其他物質的消耗速率，抑制了HxR和Hx等苦味物質的生成速率。而且在冷凍4周開始，提取物組AMP含量顯著高于對照組0.12%、0.2%和0.3%，AMP的產生可以使食物產生愉快的味道，在一定程度上掩蓋苦味。以上結果表明，添加金針菇提取物不僅可以提高冷凍豬肉糜鮮味物質的含量，抑制HxR和Hx等苦味物質的生成。

表2 不同冷凍時間對照組和提取物組冷凍肉糜的核苷酸變化(%)Table 2 The nucleotide’s content of minced meat in control and extract groups at different frozen stages (%)

2.5 金針菇提取物對冷凍肉糜感官品質的影響

金針菇提取物對于冷凍肉糜感官品質的影響見表3。冷凍肉糜的感官評定主要從色澤、風味、嫩度、滋味和可接受性5個方面分析。由表3可知，隨著冷凍時間的延長，對照組和提取物組感官評價指標的評分均不斷下降。色澤方面，在冷凍1～8周，提取物組和對照組評分差異不顯著(P>0.05)，在第12周時，提取物組評分顯著(P<0.05)高于對照組，說明添加金針菇提取物不僅不會影響肉糜的顏色，還具有保持肉糜色澤穩定的作用。風味方面，在整個冷凍期提取物組的肉糜得分均顯著(P<0.05)高于對照組34.62%、25.00%、33.33%、21.74%和33.33%，說明添加金針菇提取物可以改善肉糜風味，延緩不良風味物質的產生。嫩度方面，對照組和提取物組第0周評分差異不顯著(P>0.05)，在冷凍1～12周，提取物組評分顯著(P<0.05)高于對照組9.09%、9.38%、26.92%和21.74%，說明添加提取物可以有效地減緩肉糜嫩度的下降，這可能是由于金針菇提取物中含有蛋白水解酶[36]，通過蛋白質水解增加水溶性成分，從而提高了肉糜的嫩度。滋味方面，在冷凍0～12周，提取物組的肉糜評分顯著(P<0.05)高于對照組17.14%、22.58%、12.90%、28.00%和47.37%，與鮮味物質的測定結果一致，表明添加金針菇提取物可以提高肉糜的滋味。從可接受性方面分析，貯藏的第0～4周，對照組和提取物組的評分差異不顯著(P>0.05)，肉糜冷凍至第8周時，提取物組的評分顯著(P<0.05)高于對照組23.08%和36.84%，表明添加金針菇提取物可以延長冷凍肉糜的整體品質。以上結果表明，添加金針菇提取物可以在一定程度上提高肉糜的感官品質，延長冷凍肉糜的貨架期。

表3 不同冷凍時間對照組和提取物組冷凍肉糜的感官評價Table 3 The sensory evaluation of minced meat in control and extract groups at different frozen stages

3 結論

本研究選用金針菇為原材料，利用醇提法獲得富含麥角硫因的金針菇醇提物，并通過HPLC測定麥角硫因含量為15.29 mg/g。將金針菇提取物添加到豬肉糜中(6 g/kg)，并冷凍貯藏12周。結果表明，在冷凍貯藏的第0、1、4、8和12周，添加金針菇提取物顯著降低了肉糜的pH(P<0.05)；有效地減緩整個冷凍時期豬肉糜的脂肪氧化和蛋白氧化；顯著地提高了冷凍肉糜的IMP和AMP含量(P<0.05)，降低了HxR和Hx含量，表明添加金針菇提取物可以在一定程度上增加鮮味物質的含量，并可抑制苦味物質的生成；感官評價結果表明，添加金針菇提取物可以在一定程度上提高肉糜的風味、滋味、嫩度及整體可接受性。綜上，添加富含麥角硫因的金針菇提取物可以有效延緩豬肉糜冷凍過程中的氧化變質，增強豬肉糜的鮮味，提高豬肉糜的感官品質。因此，它可作為天然抗氧化劑應用于肉類保藏。