不同凍結方式對沙光魚品質的影響

胡馨月，張 維，趙 行，李若敏，周 振，劉 冰，張夢雪，盤賽昆,2,3,4,

(1.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室，江蘇連云港 222005；3.江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗，江蘇連云港 222005；4.江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇連云港 222005)

沙光魚(Synechogobius hasta)，學名“矛尾復蝦虎魚”，屬蝦虎魚科，分布于太平洋西北部、中國、日本和韓國海域[1-2]，在連云港市沿海分布廣，沙光魚肉質細膩、口感柔潤嫩滑，營養豐富，深受消費者的喜愛[3]，有“十月沙光賽羊湯”之說[4]。新鮮沙光魚的蛋白質和水分含量高，組織蛋白酶的活性較強，捕獲后魚體易死亡，容易腐敗變質，不易貯藏，保鮮難度大[5-6]。市場多以鮮售為主，多在每年的秋季和冬季，不能滿足顧客全年消費的需求，也影響了沙光魚作為連云港特產的推廣和產業鏈的發展。因此，需要加強沙光魚保鮮相關技術的研究，延長貨架期。

水產品常用的保鮮方法為凍藏保鮮，一般采用的凍結方式有空氣凍結、鼓風凍結、浸漬凍結等[7]。在凍結過程中，冰晶的形成會造成肌肉的機械損傷，發生一系列化學反應，如脂肪氧化、鮮度變化、蛋白質冷凍變性等現象，嚴重影響凍品的品質和營養價值[5]。研究發現，水產品的凍藏品質與凍結方式、凍結速率有關[8-9]。Cai等[10]發現-55 ℃凍結日本鱸的品質優于-18 ℃凍結；胡亞芹等[9]研究發現液氮速凍比傳統凍結方式能更好地保持帶魚的品質；Boonsumrej等[11]比較了斑節對蝦液氮浸漬凍結和鼓風凍結的品質，發現液氮浸漬凍結能更好地維持斑節對蝦的品質。液氮無色、無味、化學性質穩定是一種理想的制冷劑[12]。具有凍結時間短、品質好、干耗少、雜菌少、無污染等優點，已變成食品領域環保冷凍技術研究的熱點[9,13]。液氮速凍能大大降低冰晶對組織結構的破壞，解凍后較好地保持食品原有的色、香、味[14]。目前，國內外已廣泛應用液氮速凍于水產品和其他食品的保鮮[15]。研究不同凍結方式對水產品凍藏期間品質的變化，有利于企業選擇合適的凍結方式，保證水產品的品質。對于不同凍結方式對沙光魚凍藏品質的影響研究還未見報道。

本文以沙光魚為原料，采用三種凍結方式(-80 ℃液氮速凍、-40 ℃送風凍結、-50 ℃靜止空氣凍結)處理樣品并于-18 ℃冰箱貯藏，以TVBN值、K值、鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATP酶活、TBA值、蒸煮損失率為理化指標結合冰晶形態和感官評價，研究不同凍結方式對冷凍沙光魚品質的影響，探索沙光魚最佳的凍結方法，為沙光魚的保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活沙光魚 體重200～250 g，體長30～35 cm，采購于連云港市海州區菜市場；三氯乙酸、氯化鉀、鉬酸銨、米吐爾等試劑 均為分析純，國藥化學試劑有限公司。

DW- 40W100醫用低溫保存箱 青島海爾股份有限公司；ZY/SDG-100液氮速凍機 無錫中亞環境試驗設備有限公司；JJ-2B高速組織搗碎機 金壇市天瑞儀器有限公司；TGL-16G高速臺式冷凍離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司；TP9008U溫度記錄儀 深圳市拓普瑞電子有限公司；XSP-8CP生物顯微鏡 上海光學儀器廠；KD-BM生物組織包埋機 浙江金華市益迪醫療設備有限公司；YD-1508B石蠟切片機 浙江金華市益迪醫療設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凍結方法 將新鮮沙光魚用水沖洗干凈并瀝干，隨機分為3組。分別進行如下凍結處理[16]，靜止空氣凍結：將沙光魚置于-50 ℃冰箱中進行凍結；送風凍結：將沙光魚置于-40 ℃鼓風凍結機中進行凍結；液氮速凍：將沙光魚置于-80 ℃液氮速凍機中進行凍結。將溫度探頭插入沙光魚中心位置，當樣品的中心溫度達-18 ℃時取出，將凍結好的沙光魚裝入自封袋，封口，于-18 ℃冰箱中貯藏。每隔15 d隨機取樣品測定各項指標，實驗周期為180 d。

1.3 指標測定

1.3.1 凍結曲線的測定 將自動溫度記錄儀探頭插入沙光魚中心部位，自動記錄凍結過程中的溫度變化，繪制沙光魚的凍結曲線[5,17]。

1.3.2 蒸煮損失率的測定 稱取10.0 g樣品，85 ℃水浴鍋中蒸煮15 min后取出，冷卻至室溫，用濾紙擦拭樣品表面的水分，再次稱量。按式(1)計算蒸煮損失率[18]。

式中，m1—蒸煮前樣品的總質量，g；m2—蒸煮后樣品的總質量，g。

1.3.3 TVB-N測定 TVB-N值采用GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》的方法測定。

1.3.4 TBA的測定 參照金枝等[19]的方法，取5.0 g魚肉加入20 mL 5%的三氯乙酸混合，均質2 min，雙層濾紙過濾，取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液混合均勻，沸水浴反應25 min，冷卻至室溫。在532 nm處測定吸光值，結果以mg/kg為單位。

1.3.5 K值的測定 稱取4.0 g魚肉，加入40 mL 10%高氯酸溶液，渦旋振蕩1 min，8500 r/min離心15 min，重復操作一次，合并上清液，用氫氧化鈉溶液調節pH至6.0～6.4，定容至50 mL，8500 r/min離心15 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃保存[5]。

HPLC條件：色譜柱C18，柱溫為35 ℃；流速1.0 mL/min；流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀和0.02 mol/L磷酸氫二鉀鹽1∶1(V/V)的緩沖溶液(pH 6.0)；紫外檢測器，檢測波長254 nm；進樣量為20 μL。

式中：K—次黃嘌呤核苷和次黃嘌呤之和與三磷酸腺苷及其分解物總量之比的百分率，%；ATP—三磷酸腺苷含量，μmol/g；ADP—二磷酸腺苷含量，μmol/g；AMP—磷酸腺苷含量，μmol/g；IMP—腺苷酸含量，μmol/g；HxR—次黃嘌呤核苷含量，μmol/g；Hx—次黃嘌呤含量，μmol/g；

1.3.6 鹽溶性蛋白含量的測定 參考王鳳玉[20]、趙峰等[21]的方法，稱取4.0 g魚肉，加入10倍量的0.2 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，勻漿1 min，4 ℃條件8500 r/min離心10 min，棄去上清液，以洗去樣品中的水溶性蛋白，重復操作3次。在沉淀中加入10倍量的0.5 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，浸提2 h，9000 r/min離心15 min，取上清液即為鹽溶性蛋白溶液，用雙縮脲法測定鹽溶蛋白含量。

1.3.7 Ca2+-ATPase活性的測定 在試管中加入1 mL酶液，0.3 mL Tris-maleate緩沖液，0.1 mol/L CaCl2溶液、3.18 mL蒸餾水和0.3 mL 20 mmol/L ATP溶液，25 ℃水浴中反應5 min，加入1 mL 15% TCA終止反應。用雙層濾紙過濾，在所得上清液采用鉬酸銨法測定反應中釋放出來的無機磷含量[20,22]。

式中：A、B分別為反應管和空白管生成的磷酸量(μmol)；t為反應時間(min)；鹽溶蛋白質量為1 mL反應液所含的酶量(mg)。

1.3.8 感官評定 參考胡亞芹[9]的評定方法，選取10位經過專業培訓的人員(男5女5，年齡20-30歲)組成感官評定小組，采用CSAS感官評定系統進行感官描述檢測。將經過不同凍結方式處理的沙光魚解凍清洗后，放在蒸籠上清蒸10 min。按照表1進行評分，考察色澤、氣味、組織形態、肌肉彈性，采用加權平均法，色澤、氣味、組織形態、肌肉彈性各占系數0.3、0.3、0.2、0.2，滿分為10分，沙光魚感官綜合評分低于5分時，表示沙光魚到達貨架期，不再適合食用。

表1 沙光魚感官評價表Table 1 Sensory evaluation of Synechogobius hasta

1.3.9 冰晶觀察 將刀具提前預冷，取三種凍結方式處理的沙光魚的背部肌肉，順肌纖維方向切成5 mm×5 mm×3 mm大小，放入預冷的Carnoy固定液(體積比為6∶3∶1的無水乙醇、氯仿和冰醋酸)，-18 ℃固定24 h，新鮮的樣品放入4 ℃固定24 h。固定之后經乙醇進行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色，顯微鏡觀察[23]。

1.4 數據處理

利用SPSS 26.0進行數據處理，采用Graph Pad Prism 8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 凍結曲線

沙光魚的凍結曲線如圖1所示分為三個階段，第一階段是冷卻階段，放出顯熱，降溫速凍快，靜止空氣凍結、送風凍結和液氮速凍分別用了200、25、12 min。第二階段是最大冰晶生成帶區域0 ℃～-5 ℃，在此過程中大多數的水凍結成冰[24]，30 min之內通過為快速凍結，超過為慢速凍結[25]。靜止空氣凍結、送風凍結和液氮速凍通過0 ～-5 ℃的時間分別為：315、95和8.5 min，液氮速凍能快速通過最大冰晶生成帶，對組織結構的破壞較小。第三階段，主要是凍結一些殘留的水分，顯熱和潛熱同時放出，降溫較快[8]。從圖1中可以看出，靜止空氣凍結和送風凍結屬于慢速凍結，液氮速凍為快速凍結。結果表明，液氮速凍大大縮短了凍結時間，對沙光魚的品質影響更小。

圖1 不同凍結方式下沙光魚凍結曲線Fig.1 Freezing curve of Synechogobius hasta under different freezing methods

2.2 不同凍結方式對沙光魚蒸煮損失率的影響

蒸煮損失率是評價肉制品持水力的指標之一。肉的持水性直接影響肉的多汁性、營養成分、嫩度和色澤等食用品質[26]。由圖2可知，新鮮沙光魚的蒸煮損失率為16.83%，有良好的持水能力。隨著貯藏時間的增長，三種凍結方式的蒸煮損失率均呈現上升趨勢。30 d內三組的蒸煮損失率無顯著差異(P>0.05)。從60 d開始液氮組的蒸煮損失率顯著低于其他兩組(P<0.05)，180 d時液氮速凍、送風凍結、靜止空氣凍結的蒸煮損失率分別為29.35%、35.68%、42.35%，三組存在顯著差異(P<0.05)。經靜止空氣凍結處理的沙光魚的蒸煮損失率最大，可能因為凍結速度慢，形成了較大的不規則的冰晶，破壞了沙光魚的組織結構，導致魚肉持水力下降[16]。液氮速凍對沙光魚的蒸煮損失率影響最小，說明經液氮速凍處理的沙光魚具有良好的持水能力。Inês等[27]研究發現經液氮速凍的凡納濱蝦其蒸煮損失率明顯降低，與本文結果一致。

圖2 不同凍結方式對沙光魚蒸煮損失率的變化Fig.2 The changes of cooking loss rate in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.3 不同凍結方式對沙光魚TVB-N的影響

揮發性鹽基氮(TVB-N)是指具有揮發性的氨、二甲胺、三甲胺等與腐敗相關的堿性含氮化合物[28]。TVB-N是用于評價魚類新鮮程度的指標，其值越低說明越新鮮。根據GB 10136-2016規定：TVB-N值≤15 mg/100 g為一級鮮度，二級鮮度≤20 mg/100 g，合格品≤30 mg/100 g。由圖3可知，新鮮沙光魚TVB-N值為7.25 mg/100 g，在貯藏過程中，三種凍結方式處理的沙光魚的TVB-N值均呈上升趨勢，前期增長速度較緩慢，30 d內無顯著差異(P>0.05)。后期增長速度較快[9]，靜止空氣凍結組在第105 d的TVB-N值為16.73 mg/100 g，屬于二級鮮度，液氮速凍、送風凍結分別為10.83、14.65 mg/100 g處于一級鮮度。180 d時液氮速凍、送風凍結、靜止空氣凍結TVB-N值分別為13.15、18.84、24.02 mg/100 g，液氮組依然保持一級鮮度，送風凍結組為二級鮮度，靜止空氣凍結組為合格品。結果表明液氮速凍更好地抑制TVB-N值的增長，可能是因為液氮速凍的降溫速度非常快，對細胞造成的破壞較小[29]，呈現良好的保鮮效果。

圖3 不同凍結方式對沙光魚TVB-N的變化Fig.3 The changes of TVB-N value in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.4 不同凍結方式對沙光魚TBA的影響

TBA值是評價肉制品脂肪氧化的重要指標，脂肪氧化程度越嚴重，TBA值會越大[29]。一般研究認為TBA 值超出2.0 mg/kg時，表明肉制品已變質，不能再食用[15]。如圖4所示，隨著凍藏時間的延長，三種凍結方式處理的沙光魚TBA值均呈逐漸增長的趨勢。凍藏初期TBA值增長緩慢，在30 d內三種凍結方式處理的樣品TBA值無顯著差異(P>0.05)。凍藏后期靜止空氣凍結組的TBA值上升速率最快，可能是凍結的速度慢，形成了較大的冰晶，對細胞的機械損傷較大，暴露在空氣中的損傷面積大，導致脂肪氧化程度較高[13]。180 d時液氮速凍、送風凍結、靜止空氣凍結的TBA值分別為1.15、1.65、2.13 mg/kg，靜止空氣凍結組的TBA值已超出2.0 mg/kg，不宜食用，結果表明液氮速凍可以有效抑制沙光魚的脂肪氧化。

圖4 不同凍結方式對沙光魚TBA的變化Fig.4 The changes of TBA value in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.5 不同凍結方式對沙光魚K值的影響

K值表示魚的新鮮程度的指標之一，K值越小，說明越新鮮。K值20%以下為一級鮮度，20%～40%為二級鮮度，60%～80%為初期腐敗魚[14]。如圖5所示，隨著凍藏時間的增長，三種不同凍結方式的沙光魚的K值均呈上升趨勢。新鮮沙光魚的K值為8.30%，凍藏初期三組無顯著性差異(P>0.05)。60 d之后靜止空氣凍結的K值上升速度明顯高于其他兩組，到180 d時液氮速凍、送風凍結、靜止空氣凍結的K值分別為19.78%、25.08%、32.12%，三組存在顯著性差異(P<0.05)。在整個凍藏期間液氮組的沙光魚為一級鮮度，結果表明液氮速凍能有效維持沙光魚的新鮮度，可以抑制ATP的降解。可能是因為液氮速凍的細胞較為完整，造成的機械損傷較小，抑制了微生物的生長，在ATP分解初期抑制反應，降低整體反應速率[30]。

圖5 不同凍結方式對沙光魚K值的變化Fig.5 The changes of K value in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.6 不同凍結方式對沙光魚鹽溶性蛋白含量的影響

鹽溶蛋白是評價魚肉蛋白質冷凍變性的主要指標之一，其變性會對魚肉加工特性產生很大的影響，其含量越低，表明蛋白質變性越嚴重。隨著凍藏時間的延長，不同凍結方式的鹽溶性蛋白含量均呈下降的趨勢[29]。如圖6所示，新鮮沙光魚的含量為70.49 mg/g，在凍藏前60 d時靜止空氣凍結、送風凍結、液氮速凍的鹽溶性蛋白含量分別為36.79、43.75、48.72 mg/g，比新鮮的鹽溶性蛋白降低了47.81%、37.93%、30.89%，凍藏后期與前60 d相比下降速度較為平緩。180 d時液氮速凍、送風凍結、靜止空氣凍結的鹽溶性蛋白含量為21.24、26.77、35.66 mg/g，三組鹽溶性蛋白含量存在顯著差異(P<0.05)。在整個貯藏過程中，靜止空氣凍結下降的速度最快，其次為送風凍結組，液氮組下降最慢。可能是由于蛋白質的部分結合水形成冰晶析出，導致肌動球蛋白分子之間相互形成非共價鍵進而形成超大分子的不溶性凝集，使肌動球蛋白溶解性下降[31]。結果表明，液氮組的鹽溶性蛋白含量顯著高于其他兩組，說明液氮速凍能抑制蛋白質變性，這與崔珺[31]對帶魚的研究結果一致。

圖6 不同凍結方式對沙光魚鹽溶性蛋白含量的變化Fig.6 The changes of salt soluble protein content in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.7 不同凍結方式對沙光魚Ca2+-ATPase酶活性的影響

Ca2+-ATPase酶活性用于反映肌球蛋白的完整性，活性大小可以判斷魚肉中肌球蛋白的變性程度[32]，其活性越高，說明沙光魚的品質越好。如圖7所示，隨著凍藏時間的延長，三種凍結方式處理的沙光魚的Ca2+-ATPase酶活性均呈下降趨勢。新鮮沙光魚的Ca2+-ATPase酶活性為0.355 μmol/min/mg，凍藏前期的下降速度較快，60 d時靜止空氣凍結、送風凍結、液氮速凍Ca2+-ATPase酶活性分別為0.177、0.215、0.267 μmol/min/mg，分別下降了50.14%、39.44%、24.79%；60 d后下降較為平緩，180 d時，三組的酶活性分別為0.055、0.099、0.187 μmol/min/mg，存在顯著性差異(P<0.05)。整個貯藏過程中，靜止空氣凍結組的酶活力的下降速度最快，這可能是因為肌球蛋白的球狀頭部的構象發生變化以及蛋白質的凝聚造成了Ca2+-ATPase酶活性下降[15]。Xiong等[33]研究發現，草魚肉蛋白-18 ℃凍藏30 d Ca2+-ATPase活性降低了71.4%。結果表明，液氮組的Ca2+-ATPase酶活性高于其他兩組，可能是因為液氮的凍結速度快，冰晶細小且分布均勻，較好的保持了肌球蛋白的完整性。

圖7 不同凍結方式對沙光魚Ca2+-ATPase酶活性的變化Fig.7 The changes of Ca2+-ATPase enzyme activity in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.8 不同凍結方式對沙光魚感官評價的影響

感官評價能夠直觀反映食品品質，它是根據嗅覺、味覺、視覺、觸覺等特性進行打分。通過打分的結果判斷食品品質的優劣。新鮮沙光魚組織完整，香味濃郁，肌肉富有彈性，初始的感官評分為10.0分。如圖8所示，隨著凍藏時間的延長，三種凍結方式處理的沙光魚的感官評分均呈下降趨勢。凍藏初期氣味、色澤與新鮮樣品差異不大，肌肉彈性較新鮮沙光魚略差。液氮組、送風凍結組和靜止空氣凍結組的感官評分從開始的9.84、9.72、9.67分，下降到180 d的7.18、5.52、4.46分。液氮組凍藏期間感官評分降幅最小，品質保持地較好。靜止空氣凍結組下降的速度最快，180 d時魚肉的品質已經嚴重下降，固有香味消失，肌肉松散，已經不可食用。是因為貯藏后期水產品的蛋白質變性、內源酶和微生物的作用，導致魚肉變軟，失去原有的香味，很大的降低了感官品質[34]。液氮組優于其他兩組，可以有效延緩沙光魚在凍藏過程中感官品質的下降。

圖8 不同凍結方式對沙光魚感官評價的變化Fig.8 The changes of sensory evaluation in Synechogobius hasta by different frozen methods

2.9 不同凍結方式對沙光魚冰晶形成的影響

圖9為不同凍結方式對沙光魚冰晶形成的影響，從圖中可以看出，新鮮沙光魚的組織完整、排列致密整齊，無明顯間隙。經三種凍結方式處理的沙光魚在30 d時組織均出現間隙和不同程度的破碎變形。靜止空氣凍結組織的間隙最大，有明顯的冰晶痕跡，表明靜止空氣凍結過程中形成較大且不規則的胞外冰晶，造成嚴重的機械損傷。送風凍結的組織間隙要比靜止空氣凍結的小，但形成了一些較大的冰晶也會對品質產生損害。液氮組形成的冰晶細小且均勻，組織結構較為完整與新鮮樣品最接近，對組織細胞的機械損傷最小，能較好地維持沙光魚的品質。結果表明，不同的凍結方式對沙光魚肌肉組織有很大的影響，液氮速凍可以更好地保持沙光魚的組織結構。

圖9 不同凍結方式對沙光魚冰晶形成的影響Fig.9 Effects of different freezing methods on the formation of ice crystals in Synechogobius hasta

3 結論

不同凍結方式對沙光魚的各項理化指標均產生了顯著的影響(P<0.05)。液氮組與其他兩種凍結方式相比，大大縮短了凍結時間，細胞組織較為完整，形成的冰晶細小且分布均勻。隨著凍藏時間的增加，TVB-N值、K值、TBA值和蒸煮損失率均呈上升趨勢；Ca2+-ATPase活性、鹽溶性蛋白含量和感官評分均呈下降趨勢，在整個凍藏期間液氮組的各項指標變化的幅度始終低于靜止空氣凍結和送風凍結(P<0.05)。凍藏至180 d時，靜止空氣凍結處理的樣品已不宜食用；液氮速凍處理的沙光魚依然處于一級鮮度。說明液氮速凍能較好地保持沙光魚的新鮮度，有效延緩脂肪氧化，并抑制蛋白質的冷凍變性。與其他兩種凍結方式相比，液氮速凍保鮮效果最好，能提高沙光魚凍藏期間的品質，延長貨架期。