王漿酸對刀豆蛋白A誘導大鼠急性肝損傷的保護作用及機制研究

吳夢穎，周 茜，蔡東偉，韓 雪，牛佳卉，趙 文

(河北農業大學食品科技學院，河北省農產品加工工程技術中心，河北保定 071001)

肝臟有促進人體生物轉化、重要代謝以及解毒的功能，是很多藥物和毒物的靶器官。含有大量的亞硝酸鹽的食物、高脂肪食物、高糖食物、藥物、酒精等的攝入致使肝損傷成為常見病[1-3]。流行病學調查表明，急性肝損傷是其重要的臨床表現形式，由于其病理機制的復雜性和病情進展的迅速性，臨床防治非常困難[4-5]?，F代醫學中可用于治療肝損傷的藥物具有療效不確切、不良反應多且價格昂貴等缺點[6]。目前我國急性藥物性損傷發病率呈逐年增高趨勢，占爆發性肝功能衰竭患者的15%～30%。相比于現代醫學藥物，具有護肝作用的天然產物具有不良反應小且價廉易得的優點[7-8]。因此，開發具有輔助、預防肝損傷作用的功能性食品尤為重要。

王漿酸即反式10-羥基-2-癸烯酸(10-HAD)，是蜂王漿特有的一種具有獨特生理生物活性的物質，是蜂王漿的標志物[9-10]。研究表明，王漿酸具有激活人體受損細胞的修復機制[11-12]，促進細胞新陳代謝[13-15]，清除人體自由基，調節T淋巴細胞參與免疫反應[16-17]，提高機體的免疫力等功能。但有關王漿酸對肝臟的保護方面的研究報道甚少。本試驗利用刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)誘導建立大鼠急性肝損傷模型，研究王漿酸對急性肝損傷的保護作用并探究其作用機制，為開發具有保肝護肝、對抗肝損傷的功能性食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SD大鼠(清潔級，體重180～220 g) 購買于北京華阜康生物科技股份公司，合格證書編號：SCXK(京) 2015-0004；王漿酸(純度≥99.9%) 石家莊維奧生物科技有限公司；Con A試劑 美國Sigma公司；聯苯雙酯滴丸 北京協和藥廠；細胞凋亡檢測試劑盒、肝細胞細胞周期檢測試劑盒、流式專用溶血素FACS LYSING SOLUTION、Rat CD4 PE、Rat CD8A FITC、Rat CD3 APC 美國Becton Dickinson公司；PBS緩沖液 日本Takara公司及其配方配制；谷草轉氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)、谷丙轉氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)、乳糖脫氫酶(lactose dehydrogenase，LDH)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、干擾素γ(tumor necrosis factor γ，INF-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素-10(interleukin 10，IL-10)、白介素-6(interleukin 6，IL-6)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

FACSCAGBUR-342976型流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；1500-823型酶標儀 美國Thermo Scientific公司；組織切片機 浙江金華華海科教儀器廠；L530型臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室開發有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型的建立 大鼠適應性喂養7 d后，將90 只大鼠隨機分為9 組：陰性對照組(蒸餾水)、模型對照組(蒸餾水)、陽性對照組(150 mg/kg·BW聯苯雙酯滴丸溶液)、王漿酸低中高劑量組(30、60和120 mg/kg·BW)。每天定時灌胃一次，連續30 d。記錄大鼠每周的體重，并且隨時觀察其生長情況。末次灌胃2 h后，除陰性對照組外，其它各組經尾靜脈注射Con A(20 mg/kg)，陰性對照組注射等體積的生理鹽水。8 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。

1.2.2 肝臟、脾臟指數計算 麻醉結束后，稱重記錄體重。無菌條件下，解剖取其肝臟和脾臟，去除脂肪組織，拭干表面，稱重。根據下式計算臟器指數。

1.2.3 血清生化指標檢測 麻醉后，腹主動脈取血，靜置30～60 min，3000 r/min離心10 min，取上清備用。血清AST、ALT、LDH、AKP、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6、MDA、SOD、GSH-Px檢測嚴格按試劑書操作。

1.2.4 肝臟組織病理切片的制備 肝臟經4%多聚甲醛固定，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗凈，石蠟包埋、切片(4～5 μm)、脫蠟、蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染液，用中性樹膠將切片固定在載玻片上[18]。光學顯微鏡下觀察大鼠肝臟形態學變化。

1.2.5 大鼠肝臟細胞周期及細胞凋亡 在光學顯微鏡下，用PBS緩沖液調節每個流式管中肝臟細胞濃度至1×106/mL，制成肝細胞懸液，3000 r/min離心5 min，棄去上清液，控干。加入1 mL wash buffer洗脫液洗脫重懸細胞，3000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復兩次。用50 μL的DNA標記液重懸細胞。37 ℃水浴60 min，每隔15 min混勻一次。孵育結束后，加入1 mL Rinse buffer洗脫液洗脫，3000 r/min離心5 min，棄掉上清液。加入0.1 mL FITCBrdU抗體buffer，室溫避光30 min。加入0.5 mL PI/RNase Staining Buffer，室溫避光30 min。3 h內用流式細胞儀分析肝細胞周期的變化及細胞凋亡情況。

1.2.6 大鼠外周血和脾臟T淋巴細胞亞群 麻醉后，腹主動脈取血，-20 ℃保存備用。在光學顯微鏡下，用PBS緩沖液調節每個流式管中肝臟細胞濃度至1×106/mL，制成脾細胞懸液。向流氏管中加入100 μL脾細胞懸液，依次加入CD3-APC 3.5 μL、CD4-PE(藻紅蛋白)3.5 μL、CD8-FITC(異硫氰酸熒光素)2 μL，混勻，避光保存15 min。加入2 mL紅細胞裂解液1×FACS Lysing Solution，混勻，避光保存10 min。2500 r/min離心5 min，棄上清液，控干，加入2 mL PBS緩沖液洗滌，2500 r/min離心5 min，棄上清液。樣本加入0.5 mL PBS緩沖液以后，4 ℃避光保存1 h，上機進行FACS檢測。

1.3 數據處理

肝細胞凋亡、脾臟及外周血T淋巴細胞亞群數據用Cellquest專業軟件分析，其他數據采用統計軟件SPSS 17.0進行分析。結果用平均值±標準差(±s )表示。多組間比較采用Oneway-ANOVA分析。

2 結果與分析

2.1 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠體重和臟器指數的影響

由表1可知，與陰性對照組相比，模型組大鼠肝臟指數、脾臟指數均極顯著升高(P<0.01)，說明肝損傷造模成功；低劑量組大鼠肝臟指數顯著升高，陽性對照組脾臟指數顯著升高(P<0.05)，高劑量組脾臟指數極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，低、中劑量組肝臟指數顯著降低(P<0.05)，陽性對照組、高劑量組大鼠肝臟指數極顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各處理組大鼠脾臟指數極顯著降低(P<0.01)。與陽性對照組比較，低劑量組大鼠肝臟指數顯著升高(P<0.05)。

表1 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠體重和臟器指數的影響(±s ，n=10)Table 1 Effect of royal jelly acid on body weight and organ index of rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

表1 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠體重和臟器指數的影響(±s ，n=10)Table 1 Effect of royal jelly acid on body weight and organ index of rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

注：與陰性對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較#P<0.05，##P<0.01；與陽性對照組比較＆P<0.05，＆＆P<0.01；表2同。

組別 劑量(mg/kg·bw) 動物(只) 體重(g) 肝臟指數(mg/g) 脾臟指數(mg/g)陰性對照 0 10 295.28±7.03 31.84±3.91 2.17±0.27模型對照 0 10 289.92±5.92 41.21±34.94** 4.61±1.35**陽性對照 150 10 293.10±8.96 31.72±4.15## 2.82±0.87*##王漿酸低劑量 30 10 292.67±8.68 36.66±2.21*#＆ 2.63±0.85##王漿酸中劑量 60 10 293.63±10.88 34.18±2.80# 2.64±0.72##王漿酸高劑量 120 10 296.79±11.98 32.80±1.94## 2.88±0.63**##

2.2 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠肝功能的影響

由表2可知，與陰性對照組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、LDH和AKP活性均極顯著升高(P<0.01)，說明肝損傷造模成功；與模型組比較，陽性對照組和高劑量組血清ALT、LDH和AKP活性均極顯著降低(P<0.01)，中劑量組LDH活性顯著降低(P<0.05)。與陽性對照組相比，王漿酸中、高劑量組各指標均無顯著性差異，低劑量組LDH活性極顯著升高(P<0.01)。結果表明，王漿酸各劑量組可以降低血清中AST、ALT、LDH、AKP的酶活力，其中高劑量組效果與聯苯雙酯滴丸相當。

表2 王漿酸對Con A誘導大鼠急性肝損傷血清中AST、ALT、LDH和AKP的影響(±s ，n=10)Table 2 Effect of royal jelly acid on AST, ALT, LDH and AKP in serum of rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

表2 王漿酸對Con A誘導大鼠急性肝損傷血清中AST、ALT、LDH和AKP的影響(±s ，n=10)Table 2 Effect of royal jelly acid on AST, ALT, LDH and AKP in serum of rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

組別 劑量(mg/kg·bw) 動物(只) AST(U/L) ALT(U/L) LDH(U/L) AKP(U/L)陰性對照 0 10 20.98±6.81 14.77±3.27 493.26±24.44 172.80±25.24模型對照 0 10 34.24±8.72** 29.94±7.66** 673.85±23.56** 226.18±26.89**陽性對照 150 10 23.96±6.17## 19.04±4.77*## 532.62±33.31## 154.72±24.75##王漿酸低劑量 30 10 31.42±9.95* 23.61±8.22* 670.80±32.51**＆＆ 194.77±15.16王漿酸中劑量 60 10 26.09±5.08 23.71±4.04** 567.56±38.66# 194.10±26.06王漿酸高劑量 120 10 23.72±4.51## 17.06±7.30## 516.14±31.12## 149.98±26.61##

2.3 病理組織學檢查結果

由圖1可見，模型組肝細胞腫脹，可見炎細胞浸潤，有細胞發生空泡變性。王漿酸低劑量組有炎細胞浸潤，肝細胞仍有腫脹；王漿酸中劑量組的炎癥程度明顯輕于模型組；王漿酸高劑量組與中劑量組肝臟的炎癥反應與低劑量組類似；陽性對照組肝細胞有輕度腫脹。

圖1 王漿酸對Con A誘導大鼠急性肝損傷肝臟組織的病理學影響(HE，400×)Fig.1 Pathological effect of royal jelly acid on liver tissue in rats with acute liver injury induced by Con A (HE, 400×)

2.4 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷肝大鼠肝細胞凋亡的影響

由圖2可知，與陰性對照組相比，模型組大鼠肝細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)，說明模型建立；與模型組相比，陽性對照組和王漿酸各劑量組大鼠肝細胞凋亡率均極顯著降低(P<0.01)；與陽性對照組相比，王漿酸高劑量組無顯著性差異，低、中劑量組極顯著升高(P<0.01)。因此，王漿酸各劑量組均可顯著抑制急性肝損傷大鼠的肝細胞凋亡，高劑量組效果與聯苯雙酯滴丸相當。

圖2 王漿酸對Con A誘導大鼠急性肝損傷肝細胞凋亡的影響(±s，n=10)Fig.2 Effect of royal jelly acid on apoptosis of hepatocytes in rats with acute liver injury induced by Con A (±s, n=10)

2.5 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠血清細胞因子的影響

由圖3可知，與陰性對照組比，模型組大鼠血清中INF-γ、TNF-α、IL-10和IL-6的含量極顯著升高(P<0.01)，說明Con A引發機體發生炎癥反應；與模型組相比，各處理組大鼠血清中INF-γ、TNF-α、IL-10和IL-6的含量極顯著降低(P<0.01)；與陽性對照組相比，王漿酸各劑量組大鼠血清中IFN-γ含量極顯著升高(P<0.01)。結果表明，王漿酸各劑量組均能不同程度的抑制Con A引起的炎癥反應，但效果不及聯苯雙酯。

圖3 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠血清中細胞因子的影響(±s，n=10)Fig.3 Effect of royal jelly acid on cytokines in serum of rats with acute liver injury induced by Con A (±s, n=10)

2.6 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠肝臟氧化應激的影響

由表3可知，與陰性對照組比較，模型組大鼠血清SOD、GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著性升高(P<0.01)，說明Con A影響大鼠肝臟的氧化應激。與模型組相比，陽性組及各劑量組大鼠血清中MDA含量極顯著降低(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01)。與陽性對照組相比，王漿酸各劑量組大鼠血清中MDA活性極顯著升高(P<0.01)；王漿酸低、中劑量組SOD，低劑量組GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)。

表3 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠肝臟抗氧化能力的影響(±s ，n=10)Table 3 Effect of royal jelly acid on antioxidative capacity of liver in rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

表3 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠肝臟抗氧化能力的影響(±s ，n=10)Table 3 Effect of royal jelly acid on antioxidative capacity of liver in rats with acute liver injury induced by Con A (±s , n=10)

組別 劑量(mg/kg·bw) 動物(只) MDA(nmol/mg Pro) SOD(U/mg Pro) GSH-Px(U/mg Pro)陰性對照 0 10 6.33±0.50 443.74±17.02 527.52±55.41模型對照 0 10 10.65±0.58** 285.13±19.47** 374.12±67.84**陽性對照 150 10 4.65±0.42**## 442.21±9.91## 485.74±76.33**##王漿酸低劑量 30 10 8.11±0.53**##＆＆ 361.54±13.15**##＆＆ 437.47±58.94**##＆＆王漿酸中劑量 60 10 8.35±0.55**##＆＆ 373.30±15.52**##＆＆ 451.97±47.00**##＆＆王漿酸高劑量 120 10 7.67±0.40**##＆＆ 427.75±11.19*##＆＆ 457.78±50.66**##＆＆

2.7 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠肝細胞周期的影響

由圖4可知，與陰性對照組比較，模型組大鼠處于G1期的細胞數極顯著降低、G2期的細胞數極顯著升高(P<0.01)，處于S期的細胞數顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和王漿酸高劑量組大鼠處于G1期的細胞數極顯著升高(P<0.01)，王漿酸低、中劑量組大鼠處于G1期的細胞數顯著升高(P<0.05)；陽性對照組大鼠處于S期的細胞數極顯著降低(P<0.01)；陽性對照組和王漿酸各劑量組處于G2期的細胞數極顯著降低(P<0.01)。與陽性對照組比較，王漿酸各劑量組無顯著性差異。

圖4 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠肝細胞周期的影響(±s，n=10)Fig.4 Effect of royal jelly acid on the hepatocyte cycle of rats with acute liver injury induced by Con A (±s, n=10)

2.8 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響

由圖5可知，與陰性對照組比較，模型組大鼠外周血中的CD3+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+的量顯著降低(P<0.05)，CD3+CD4+的量極顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，陽性對照組和王漿酸各劑量組極顯著提高CD3+CD4+的含量(P<0.01)，顯著提高CD3+、CD3+CD8+的含量(P<0.05)；與模型組比較，王漿酸中、高劑量組大鼠外周血中CD4+/CD8+極顯著升高(P<0.01)，陽性對照組和王漿酸低劑量組大鼠外周血中CD4+/CD8+顯著升高(P<0.05)。王漿酸各劑量組與陽性對照組相比較無顯著性差異。

圖5 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠外周血T淋巴細胞亞群百分數及比例的影響(±s，n=10)Fig.5 Effect of royal jelly acid on the percentage and proportion of T lymphocyte subsets in peripheral blood of rats with acute liver injury induced by Con A (±s, n=10)

2.9 王漿酸對Con A誘導急性肝損傷大鼠脾臟T淋巴細胞亞群的影響

由圖6可知，與陰性對照組比較，模型組大鼠脾臟中的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+的百分含量極顯 著 降 低(P<0.01)，CD4+/CD8+極 顯 著 升 高(P<0.01)，說明Con A的攝入會導致機體免疫力的下降；王漿酸各劑量組大鼠脾臟中的CD3+的百分含量顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和王漿酸各劑量組均能極顯著提高大鼠脾臟中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+的百分含量(P<0.01)；陽性對照組和王漿酸低劑量組大鼠脾臟CD4+/CD8+極顯著降低(P<0.01)，王漿酸中劑量組大鼠脾臟CD4+/CD8+顯著升高(P<0.05)。王漿酸各劑量組與陽性對照組相比較無顯著性差異。

3 討論與結論

當Con A對肝細胞產生實質性損害時，會增加肝細胞膜的通透性，血液中AST、ALT、LDH、AKP等酶的濃度會隨著Con A攝入的增加而增多。當血液中AST和ALT的活力異常升高時，說明肝臟組織已經到了急性損傷的病理期。此時肝小葉內會出現大量的炎性細胞浸潤現象并且會伴隨肝細胞的大量壞死和凋亡[19-20]。

當機體受到Con A的刺激，肝臟進入急性損傷的病理期時，肝小葉內會出現大量的炎性細胞浸潤并伴隨肝細胞的大量凋亡[21-22]。Con A進入血液以后會與中性粒細胞以共價鍵的形式相結合，最終導致肝臟細胞受到其結合產物的浸潤[23]。同時還伴隨著誘導血管內皮細胞表達細胞間黏附分子以及血小板激活因子等，從而引起肝細胞損傷/凋亡。

機體內肝竇與Con A會發生特異性的結合，使得T淋巴細胞釋放大量的炎癥因子，對肝臟起到一定的損傷的作用。研究表明，當肝臟發生急性損傷時，肝小葉內會出現大量的炎性細胞浸潤現象。TNF-α、IL-6和INF-γ等在引發急性肝損傷的過程中起著至關重要的作用，大鼠被提前腹腔注射抗TNF-α、IL-6、INF-γ的單抗，機體能夠很好地預防肝損傷的發生[24]。據國外研究報道，Con A誘導的急性肝損傷會導致機體內炎癥因子如TNF-α、INF-γ、IL-6的升高。這與本實驗結果一致。

當機體肝臟細胞受到破壞的時候，自由基大大增加，出現氧化應激，導致機體消耗大量的SOD來消除機體內的自由基，以此來對肝損傷進行自我修復，最終會導致機體內SOD減少。細胞膜的結構會因為MDA的大量存在而受到損害，導致細胞腫脹壞死，間接反映細胞損傷的程度[25]。當用Con A對肝細胞進行損傷的時候，機體會以產生大量MDA的形式來對機體組織進行破壞，同時機體會自身的應激反應來對受損細胞進行修復，GSH-Px是這個過程的主要修復工具。本研究表明，王漿酸各劑量組能通過調節MDA、SOD、GSH-Px的含量來增強機體的抗氧化能力，從而達到對抗肝損傷的目的。

本細胞周期試驗中，與陰性對照組相比較，模型組G1期的細胞百分比顯著下降，S期細胞百分比差異不顯著，說明機體的肝細胞進行了一系列的增殖，Con A促進細胞進行分化。Con A會刺激細胞由原來的靜止狀態轉化為活躍態，從而進入分裂期，進行細胞增殖，然而王漿酸劑量組可以很好地抑制Con A誘導肝損傷大鼠的肝細胞增殖，從而使機體恢復正常免疫活性以達到護肝的作用。

為了進一步闡明王漿酸是如何的發揮護肝作用，本研究還檢測了脾臟及外周血中T淋巴細胞亞群的表達水平以及肝細胞細胞周期的變化。CD3+T淋巴細胞是機體免疫能力的標志。CD4+/CD8+反映機體免疫能力平衡狀況[26]。以CD4+T淋巴細胞為主的炎癥細胞的浸潤是Con A造成的肝損傷的主要形式。CD4+輔助性T淋巴細胞可發展成功能不同的Th1和Th2亞群。Con A造成急性肝損傷，會使CD4+發展成Th1亞群，而Th1會分泌大量的IFN-γ，這與本實驗結果相符合。模型組大鼠脾臟及外周血中的CD3+比陰性對照組低，原因是足劑量的Con A誘導使脾臟中CD3+T細胞的數量以及活化程度均受到了抑制，造成機體的免疫功能下降；CD8+細胞比例顯著降低，可能與造成免疫損傷過程中導致淋巴細胞消耗較多或與向肝臟內大量浸潤有關[27]。本研究表明，王漿酸各劑量組能顯著提高CD3+的含量，說明王漿酸各劑量組可以提高機體的免疫力；并且可以穩定外周血中CD4+/CD8+的比例，以此來穩定機體的免疫功能。

Con A誘發了大鼠急性肝臟損傷模型是以T淋巴細胞為介導的肝臟損傷為特征，能夠較好的模擬人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病的肝損傷過程。Con A作為一種植物凝集素可促進T細胞分裂和巨噬細胞激活，促進TNF-α以及干擾素類的釋放，從而導致線粒體代謝障礙，發生細胞凋亡。王漿酸對Con A誘導的大鼠肝損傷和脾臟腫大有一定的改善作用，而且可以降低血清中ALT、AST、LDH和AKP酶活性，增強機體的抗氧化能力；恢復脾臟T淋巴細胞亞群比例，加強機體免疫力；通過減少機體MDA的合成，增加SOD、GSH-Px的合成來增強機體的抗氧化能力；并且可以抑制細胞分裂。同時各劑量組肝細胞凋亡及肝細胞炎性損傷情況均有明顯改善。但王漿酸對Con A誘導的特異性肝損傷的保護作用機制的具體機理需要進一步闡明，王漿酸調節細胞因子的通路需進一步研究。以上結果說明王漿酸具有護肝作用，為其功能性食品的進一步開發利用提供了一定的理論依據。