食物中L-肉堿含量及其測定方法的研究進展

王 新，王秋舉, ，劉洪健，王 寧，徐永平，馬 悅，張東鳴,2,

(1.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林長春 130118；2.通化師范學院，吉林通化 134000；3.吉林省水產技術推廣總站，吉林長春 130012；4.大連賽姆生物工程技術有限公司，遼寧大連 116620)

L-肉堿的首次發現是在上世紀初(1905年)[1]，從最開始的認知維生素Bt到現在所謂的功能全面的免疫增強劑已有百余年的歷史。隨著L-肉堿功能研究的不斷深入，人們對L-肉堿的認識也逐漸增多。目前L-肉堿已被應用到養殖、食品、生物制藥等多種行業中，不僅成為人們飲食當中不可缺少的營養物質，更是老年人、孕婦、病人等一些特殊人群的保健佳品。現已證明L-肉堿能加快細胞對脂肪的消耗，為人體提供能量，同時具有抗氧化、抗衰老和提高免疫力等功能[2]。因此，保證充足的L-肉堿的攝入量對于人體健康和疾病預防具有重要意義。人體中L-肉堿來源于日常膳食和自身合成兩部分，日常膳食為L-肉堿的主要來源，約為75%[3]。因此，探明不同食物L-肉堿含量，建立合理的飲食結構來保證L-肉堿的基本需要，對于人類充分利用L-肉堿，保持健康至關重要。

L-肉堿幾乎存在于所有動植物、細胞及微生物中，L-肉堿含量在不同物種間變化較大，而且即使在同物種間，可能也會因為不同的攝食類型和生活方式而產生較大差異。尤其是在動物組織中，L-肉堿含量會受到年齡、性別、營養、疾病等多種因素的影響。成年健康動物血液中L-肉堿含量與L-肉堿攝入量成正相關[4]。雖然世界各國對L-肉堿的生理、生化、營養和臨床等方面進行了深入而廣泛的研究，但國內對L-肉堿的研究相對較少，尤其是關于食物中L-肉堿含量及其測定方法的相關報道甚少[5]。因此，精確地測定L-肉堿含量，合理地利用食物中所含L-肉堿，對人類保健具有重要的意義。本文基于以往研究的結果，對食物中L-肉堿含量和測定方法進行整理和分析，為正確認識L-肉堿、外源攝食肉堿的人群提供基礎理論依據，為優化L-肉堿檢測方法并應用于實踐提供參考數據。

1 食物中L-肉堿的含量

在哺乳類動物中，主要合成L-肉堿的部位是肝臟，此外在睪丸和腎臟中也能合成[6]。動物體中肌肉和心臟L-肉堿含量較高，人體98%的L-肉堿存在于肌肉和心臟中，其它組織中含量較少，血漿與肌肉L-肉堿濃度之比為1∶50[7]。鮮肉類食品L-肉堿含量最高(500～1200 mg/kg)，其次是魚類、雞肉和奶制品，而蔬菜、水果等植物性食品中L-肉堿含量最少[8]。通常情況下，多樣化的飲食方式較為科學合理，能滿足機體L-肉堿的需求，而素食者對L-肉堿的需求往往會增加。動物性食品、植物性食品、奶制品和雞蛋中總L-肉堿及游離L-肉堿含量的存在情況分別見表1～表3。

表1 常見動物性食品中L-肉堿含量Table 1 L-Carnitine contents in the routine animal food

從表1可知，肉類中除臟器外總L-肉堿含量最高的是山羊肉(184.0 mg/100 g)，其次是袋鼠肉(166.0 mg/100 g)、駱駝肉(110.9 mg/100 g)、馬肉(117 mg/100 g)、牛肉(95.3 mg/100 g)、鹿肉(74.0 mg/100 g)和豬肉(22.4 mg/100 g)。人類食物中L-肉堿的主要來源是肉類，與其它組織相比，多數動物的肌肉組織L-肉堿含量較高[9-10]。

蔬菜和水果中L-肉堿含量較少，除去皮后鱷梨(8.1 mg/100 g)和豌豆(5.7 mg/100 g)外，一般少于5 mg/100 g。黑醋栗、蘆筍、黃瓜(去皮)、馬鈴薯(煮過)、樹薯、西紅柿、菠菜、粳米(煮后)、面條(煮后)中均未檢測到L-肉堿，這就說明植物性食品中L-肉堿含量較少，這是由于大多數植物中缺少L-肉堿的前體——賴氨酸和蛋氨酸的原因[21]，具體含量見表2。

續表 1

表2 常見植物性食品中L-肉堿含量Table 2 L-Carnitine contents in the routine animal plant food

由表3可知，奶制品中L-肉堿的含量變化較大，酪乳(粉末)和明斯特乳酪L-肉堿含量相對較高[22]，分別是(22.5 mg/100 g)和(19.8 mg/100 g)，雞蛋蛋白和卵黃中L-肉堿水平分別為(0.3 mg/100 g)、(0.8 mg/100 g)。奶制品L-肉堿含量的測定在不同的研究中出現了一定的差異，樣品的測定方法和樣品來源的動物及其年齡、飼養等因素均會影響奶制品中L-肉堿水平[11,23-24]。

表3 奶制食品和雞蛋的L-肉堿含量Table 3 L-carnitine contents in the dairy products and eggs

人類營養學的研究表明，每個成年人身體中平均含有25 g/L-肉堿，建議每天應從飲食中攝取L-肉堿量為0.3～1.9 mg/kg[25]。平衡的飲食能為人體提供76.5 mg/L-肉堿，其中77.8%來源于肉類，14.4%來源于日常食物和蛋類[26]。飲食均衡的人群并不需要額外補充，食物中所含L-肉堿即可滿足生理代謝的需要[27-28]。而素食主義者L-肉堿的攝取量約為16.2 mg，嚴格素食主義者L-肉堿的攝取量則小于16.2 mg，因此外源攝取L-肉堿含量則不能滿足需要。雖然人體內存在L-肉堿的合成途徑，但該途徑極容易受到維生素C和二價鐵離子的影響，所以對于素食主義者和嚴格素食主義者而言，由于所攝食的肉類較少，為滿足機體需要勢必要依賴L-肉堿的內源合成途徑來保持L-肉堿的穩態，這就要求機體確保具有足夠多L-肉堿合成的所有底物和輔酶因子，尤其是蛋氨酸、賴氨酸、維生素C、維生素B6和鐵離子等[29]。

L-肉堿是安全無毒的小分子物質，被人體吸收后不會轉化分解為其它物質，但是L-肉堿如果不能被腸道吸收，就會經腸道菌群及酶作用下分解產生氧化三甲胺。氧化三甲胺是三甲胺形成的N-氧化物[30]。近年來，氧化三甲胺在各種病理狀態中的作用引起了廣泛的關注。心血管疾病是導致人類死亡最主要的疾病之一，而動脈粥樣硬化是造成心血管疾病形成的主要病理基礎。因此，在滿足機體需要的情況下，應避免攝食過量的肉類物質，避免過多的L-肉堿在腸道滯留，從而減少氧化三甲胺水平，保證身體健康[31-33]。

2 L-肉堿含量測定方法的研究

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法主要分為直接測定和間接檢測兩種。衍生化反應是一種利用化學變換把化合物轉化成類似化學結構的物質，一般來說，一個特定功能的化合物參與衍生反應，溶解度、沸點、熔點、聚集態或化學成分會產生偏離。由此產生的新的化學性質可用于量化或分離。離子對試劑法是通過電力能力較強的離子化合物與目標離子化合物形成中性的分子態物質，這樣大大增強了該目標離子化合物的保留能力，便于檢測。高效液相色譜法一般均通過衍生化反應和離子對試劑法進行間接檢測，因用C18柱和C8柱可以分離γ-丁基甜菜堿和L-肉堿，但不能分離巴豆甜菜堿和L-肉堿，因此一般不采用高效液相色譜法直接檢測。莫紫梅[34]利用離子對試劑法測定保健食品中L-肉堿含量得出該方法快速、準確、重復性好，可作為口服液類輔助降血脂保健食品的質量控制方法。李景華等[35]建立了測定降血脂藥物中L-肉堿含量的簡便方法，該方法操作簡便、快速、有良好的準確度。臨床上，人體血漿的樣本可以用乙腈和甲醇混合液萃取出來，并用0.5 mL的硅膠柱進行分離，通過高效液相色譜法進行L-肉堿、乙酰肉堿的檢測[36]。游離L-肉堿被衍化為紫外可以吸收的酯化形式，所形成的衍生物的穩定性，在不同時間內依然能通過HCLP進行檢測。峰面積和濃度之間的線性關系為y=950.0x-104.2，r=0.9999，游離L-肉堿和總L-肉堿的批內和批間的相對標準偏差在1.23%和1.18%[37]。其他人的研究結果顯示用這種方法所得到的精液中游離L-肉堿的回收率在91.6%～96.5%[38]。尿液中L-肉堿和酰基L-肉堿的測定方法被進一步的發展[39]，L-肉堿和酰基L-肉堿與熒光衍生試劑進行反應，通過液相的梯度洗脫進行測定[40]。棕櫚酰L-肉堿和硬酯酰L-肉堿的分析恢復率在70%～76%，L-肉堿及其它酰基L-肉堿的恢復率在96%以上。Sun等[41]也是通過衍生化處理，并通過HCLP進行連續血樣L-肉堿水平的測定，游離L-肉堿回收率為98.2%，總L-肉堿水平為96.3%。綜合以上研究說明高效液相色譜法是一種操作簡便、準確度高、重復性好的測定L-肉堿的方法且方法應用廣泛。

2.2 質譜分析法

質譜分析法是一種有效且多功能的分析技術，它利用電磁學原理將化合物電離成具有不同質量的離子，然后按其質荷比的大小依次排列成譜收集和記錄下來，因此，可以用來確定未知化合物成分、定量已知材料，并且闡述有機物和無機物的化學組成和分子結構[37]。質譜分析是一種敏感的分析方法，該方法具有較強的敏感性和專一性，可控性強，并且具有準確、快速、高效、高通量的優勢。但是目前，由于成本較高，這種方法并未被多數實驗室所采用，該法多用于臨床上分析檢測先天性L-肉堿代謝性障礙等疾病，而并非是對L-肉堿水平的定量。質譜分析法主要包括質譜串聯法(MS/MS)、同位素稀釋電噴霧與質譜串聯法、液相色譜與串聯質譜聯合技術。

MS/MS方法可以測定低水平肉堿的樣本,隨著對質譜使用程度的增加，MS/MS方法測定血漿中游離肉堿和總肉堿逐漸得到發展和改良，即酸水解MS/MS法和堿水解MS/MS法，這些改良方法均提高了樣本的檢測速率和準確度[42]。同位素稀釋電噴霧與質譜串聯法使用快速原子轟擊產生的電離作用而測定，只要求很少的樣品準備時間和步驟，在專一性和準確性、精確度上與放射法一樣好，并且更為方便有效[43]。現今已經越來越多的研究將液相色譜與串聯質譜進行聯合使用測定L-肉堿水平，與LCMS相比，LC-MS/MS具有更高的敏感性和專一性，但是成本要高很多，多數均是在醫院實驗室使用[44]。

2.3 電泳法

電泳法(CE)是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。CE檢測系統包括直接和間接的紫外光、熒光、電化學和其他類型的檢測器。但是，L-肉堿在紫外-可見光譜區的吸收是很弱的，并且缺乏熒光。直接分離方法不能測定L-肉堿水平，因此必須要進行衍生化處理[45]。但現在有研究將電泳技術與質譜技術(CE-MS)聯合使用測定L-肉堿，取得了良好的效果。CE-MS的優勢是不需要進行L-肉堿的衍生化反應，另外，該法雜質干擾的影響較小，電泳時間較短。這種方法是一種適合測定樣品組分的理想方法[46]。但電泳法在實驗室使用較少，因為程序比較復雜、可重復性低。

2.4 分光光度分析法

分光光度法是檢測L-肉堿的傳統方法，它是建立在酶反應的基礎上，即以乙酰CoA和L-肉堿為反應底物，乙酰肉堿轉移酶為催化劑，生成乙酰-L-肉堿后再與相應顯色劑反應生成可檢測的黃色產物(DTNB)，顏色深淺與L-肉堿水平在線性范圍內呈正比，利用分光光度讀取分光光度值，以此計算得到樣本中的游離L-肉堿水平。

Matsumoto等[47]發明了一種熒光的方法，通過肉堿脫氫酶測定了不同年齡男性和女性血清中游離L-肉堿和酯酰L-肉堿水平，證實了L-肉堿隨年齡的變化趨勢和性別不同導致L-肉堿水平的差異。熒光光譜法測定L-肉堿的方法的優化，無外乎就是對各步驟進行最優化處理。Wan等[48]改良了一種方法，減少了成本，并且能在1 h內得到游離L-肉堿和總L-肉堿的結果。這種方法要求簡單的兩部樣品準備的步驟，之后采用隨機存取化學分析儀進行結果測定。該方法價格便宜，操作相對簡單，不需要衍生化樣本。但其檢出限遠遠高于液相和質譜法等方法，而且酶反應過程中，酶易失活，樣品制備復雜，操作時間長，雜散光干擾，可重復性與可控性差，不適合大量樣品的快速檢測。

2.5 放射分析法

放射-酶分析法是將乙酰CoA用C14標記，即[C14]乙酰CoA與L-肉堿反應生成[C14]乙酰L-肉堿和輔酶A(CoASH)，將乙酰L-肉堿從乙酰CoA中分離出來，并測定L-肉堿的含量[49]。由于一些限制性因素，如：特異性、線性范圍、脫蛋白，原有的方法總是在被進行重復和改良，改良后的方法又具有了一定特性。Seline等[15]對放射-酶法測定L-肉堿含量進行了一些研究發現在分析過程中一些混合物具有放射性現象并對試驗結果產生影響。除此之外，還測定了一些動植物樣本中L-肉堿水平。在超過15 μmol/L時，線性關系均才是成立的，此方法可被用于測定肉類和蔬菜類中的總L-肉堿、游離L-肉堿和乙酰L-肉堿的量。

2.6 電化學法

電化學法創造了連續檢測化合物的可能性，這種方法使用帶有電化學傳感器作為檢測器的不同連續系統，獲得了理想的測定效果。目前報道的有流動注射分析儀技術和順序注射分析技術[50]。Isabel等[51]通過使用流動注射(FI)和固定的肉堿乙酰基轉移酶生物反應器，對嬰兒配方食品樣品進行分析，以確定其游離L-肉堿含量。該方法基于分光光度法，通過與肉堿乙酰基轉移酶、乙酰輔酶A和二硫代苯甲酸酯反應來進行。龔尚于等[52]采用流動注射-化學發光法測定減肥藥物中L-肉堿含量，方法基于在堿性介質中，L-肉堿對Ag(Ⅲ)配合物-魯米諾化學發光體系有顯著的增敏作用，且化學發光強度在一定范圍內與L-肉堿的濃度呈線性關系。電化學技術具有儀器設備簡單、易于操作，靈敏度和準確度高，實用性強，易攜帶，且其費用較低等優點。

3 結語

L-肉堿因其特有的生理功能，在食品、醫藥等領域得到了越來越廣泛的關注，因此對食物中L-肉堿的準確含量及其檢測方法進行總結是十分必要的。本文詳細地介紹了以往研究中食物L-肉堿的水平及檢測方法，同時也對微生物代謝L-肉堿后所產生的有毒物質氧化三甲胺進行了分析，這為人們準確地掌握各種食物中L-肉堿含量及合理地利用L-肉堿提供了基礎數據和建議。酶促反應與分光光度法聯合使用是實驗室常用的L-肉堿測定方法，但其精確度不足。隨著儀器設備和分析方法的不斷發展，高效液相色譜法、電泳法、質譜法、電化學法等檢測L-肉堿的研究備受關注，這些方法選擇性好、靈敏度高，但操作過程過于繁瑣，因此，未來L-肉堿檢測方法將會進一步的優化組合各種前處理方法和檢測方法，向更加方便快速、更加準確、精確的方向發展。