HPV的分子生物學檢驗技術進展研究

王衛芳 李家磊 賈克利 胡淼 賀志安

[摘 要] 目前宮頸癌是成年女性的常見癌癥。本著關愛女性健康，使學生熟練的掌握宮頸癌的“原兇”HPV即人類乳頭瘤病毒的原則，以HPV分子生物學檢測手段為例，系統地梳理了HPV分子生物學檢測技術。以社會需求為導向，在教學過程中加入實踐案例，豐富教學過程，彰顯分子生物學檢驗在臨床實踐應用中的重要地位，提高學生的積極性，樹立檢驗學生仁心仁術的專業理念，培養“四位一體”的醫學檢驗技術專業應用型人才。

[關鍵詞] HPV;宮頸癌;分子生物學檢測技術;應用型人才

[基金項目] 2017年度新鄉醫學院校級教改課題重點項目“新鄉醫學院三全學院，供給側改革下校企聯合培養‘醫學檢驗工程師模式的探索與實踐”（20602008）

[作者簡介] 王衛芳（1990—），女，河南太康人，碩士，新鄉醫學院三全學院醫學檢驗學院助教，主要從事細胞免疫學研究。

[中圖分類號] G642? ? ? ?[文獻標識碼] A? ? ?[文章編號] 1674-9324（2021）17-0034-04? ? [收稿日期] 2021-01-16

在新醫科背景下，以人工智能、大數據為代表的新一輪科技革命和產業變革推動著醫學發展進入新階段，對原有醫學專業提出了新要求。高等醫學檢驗教育必須樹立“優化服務生命全周期，健康全過程”的新醫學理念[1]，構建“醫教融合、注重人文、強化實踐、校企協同”四位一體、能力本位的醫學檢驗技術專業應用型人才培養新模式。為提升醫學檢驗專業技術人才崗位適應能力，本文以引起女性宮頸癌及宮頸組織癌前病變的重要因素——HPV（human papillomavirus，人類乳頭瘤病毒）為目標，對其分子生物學檢驗技術進行詳細的分析及梳理，對HPV的分子生物學檢測技術的發展進行匯總，體現了HPV臨床篩查的重要意義，樹立醫者仁心的情感理念。

在臨床上，宮頸癌是癌癥中最早確定的由單一原因引發的，主要原因是由HPV感染引起的，多發于女性，因此定期做HPV的檢測是十分必要的。HPV病毒為球形，直徑約0.045～0.055nm，無包膜，為環狀DNA雙鏈結構[2]。有超過200種不同類型的HPV，其中超過51種感染生殖器上皮，約14種被歸類為高風險類型，更常見于宮頸癌。在疾病發展過程中，高風險類型具有截短的非復制性生命周期的趨勢增加;而低風險、非癌癥相關的HPV類型要么無癥狀，要么會導致良性病變，從而完成其完整的復制性生命周期（如圖1）[3，4]。據有關調查報告顯示，2018年世界衛生組織（World Health Organization，WHO）數據表明，全球約有57萬新發宮頸癌病例[5]，死于宮頸癌的女性約有31.1萬名[6]。臨床中對確診宮頸癌患者的癌組織進行檢測，發現絕大多數都可以檢測到HPV[7]。2008年哈拉爾德·楚爾豪森獲得諾貝爾生理學獎，他的研究成果中闡明了HPV的感染路徑、可能入侵部位以及病毒增殖傳播和引發宮頸癌的全部過程[8]。這一研究成果為HPV的檢測奠定了重要理論基礎。

現階段HPV檢測主要以分子生物學的方法為主，以其蛋白質、核酸為研究對象。在臨床醫學中的應用，主要表現在對HPV的基因鑒定、核酸檢測以及其表達產物的檢驗分析[9]，如直接分子雜交檢測技術、PCR分子檢測技術、新興檢測技術實時熒光定量PCR法。

一、直接分子雜交檢測技術

原位雜交利用了核酸分子的堿基互補配對原則，使探針DNA和目的基因結合成雜交分子，可在組織或細胞中定位到HPV的DNA。該項技術能定位可疑DNA的具體位置，具有特異性強、敏感度高等優點，但是該檢測方法對樣本的質量要求較高，需要耗費大量勞動力和高額的成本，因此現階段無法大量在臨床中開展。

二、PCR分子檢測技術

（一）DNA測序法（DNA sequencing）

DNA測序是對PCR產物的堿基序列對進行分析，然后將測序產生的結果與DNA文庫進行對比，辨別HPV的分型。DNA測序能夠避免多種交叉反應，檢測出不同HPV分型，其特異性較好[ 10 ]。但是，檢測多重感染的不同序列，DNA測序法的檢測對其敏感度低，有時因混合型在測序時無法讀出序列而導致結果無法判斷。雖然快速測序法可對臨床標本進行高通量的常規檢測，但耗時間久、費用較貴。

（二）限制性聚合酶鏈反應技術

該技術產生的大量片段，可以在凝膠電泳上辨別。因為HPV的分型不同，所以它們的序列也各不相同。因各個基因的酶切位點不同，酶解產物不同，所以在凝膠電泳上大小與位置不同。根據在凝膠電泳上產生的片段來辨別高危型HPV的分型。該技術操作簡單且分型時間短，但對引物的要求頗高。

（三）共同引物PCR

此技術基本可以通過一次反應檢測同類所有相關型HPV病原體，與普通PCR技術相比較，它具有的快捷、高通量的優點更加明顯，使HPV的檢出率明顯提高，確保了患者的及時治療。

三、新興檢測技術

（一）流式熒光雜交法（Luminex，MAP）

此法能測出多種高危型HPV，在檢測的過程中要先將含有寡核苷酸的探針（固定有多種熒光色的乳膠顆粒）所屬的微粒分散體系混合，然后根據堿基互補配對原理，再加入Biotin標記的PCR產物，使得微球上的寡核苷酸探針與PCR產物進行雜交，最后加入藻紅蛋白標記的鏈親和素。在反應過程中結合為雜交體（微球—寡核苷酸探針—PCR產物—生物素—鏈霉親和素—聚乙烯復合物），測定時的微球會經過兩激光，一激光確定微球上的聚乙烯，另一激光確定微球上固定的探針類型，然后可以確定標本是否感染了對應的HPV亞型。在一些宮頸癌篩查試驗過程中，研究人員發現流式熒光雜交法具有高速度、高特異性、高靈敏度等優點[ 11，12 ]。

（二）實時熒光定量PCR法（real-timequantitative PCR，RT-PCR）

熒光實時定量PCR技術是在寡聚核苷酸引物作用下的模板DNA，通過“變性—退火—延伸—合成”周期的多次循環，擴增后的產物急劇積累，可通過線性關系來進行分析[ 13 ]。該法可對HPV16型和18型進行定量分析檢測，具有高特異性和高準確性。該技術把基因擴增和結果分析放到單管密閉環境中，避免了污染和不能定量的問題，是測定HPV的極好方式。哈爾濱醫科大學附屬醫院檢驗科用此法對424例門診患者陰道分泌物中HPV的8個基因型（HPV16、18、31、33、45、52、56、58型）進行了檢測。通過對數據的分析之后發現，這種方法操作簡練、反應迅速[ 14 ]。目前，這種方法的應用較廣泛。

四、結論

宮頸癌作為女性健康的“殺手”，主要原因就是由HPV感染引起的，因此女性應有意識定期檢測HPV，并且在條件允許的情況下，接種HPV疫苗。Anne Hammer的研究表明，HPV能夠在人子宮宮頸中建立潛伏期[ 15 ]。周萍的研究表明HPV感染陽性率隨宮頸病變程度的加重而增高[ 16 ]。因此HPV檢測為宮頸癌早預防、早診斷、精準分型和治療提供了完整的解決方案。HPV可分高危型和低危型。研究表明，高危型HPV的持續性感染引起的宮頸癌風險更高，所以對其檢測更有意義。而HPV分子檢測能夠檢測HPV分型，因此HPV分子檢測技術正逐步取代傳統的細胞學檢測。我國HPV的分子檢測目前出現了很多新型技術，如高端的液態芯片技術、熒光定量PCR技術等，這些新興技術會成為一種新的趨勢。

國家相關政策規定，對沒有做過宮頸癌檢測的農村婦女進行免費篩查，加強大眾對宮頸癌的認識并進行積極的預防和治療。另外多項研究表明，使用免疫抑制劑的免疫缺陷人群發生宮頸癌的風險會有所提高[ 17 ]。分子生物學檢測技術的不斷發展、不斷進步、不斷成熟，使得更多的HPV的高風險類型得到檢測并且能夠將其具體分型，極大地提高了HPV檢測結果的精準度，大大地增加了臨床檢出率。

總而言之，醫學檢驗技術專業是一門跨臨床、理學、工學、基礎醫學的多學科交叉專業，學科發展迅速、新技術應用極多。為了準確把握醫學檢驗技術應用型人才崗位勝任力的內涵，構建應用型醫學檢驗技術人才的課程體系，需明確各課程在專業教學中的地位和作用，在新醫科背景下，伴隨著教育改革的蓬勃發展，臨床分子生物學檢驗技術由于其所具有的技術性、理論性以及實踐性，作為檢驗醫學領域中的重要分支，一方面需要任課教師在教學科研臨床共相長，另一方面要提升學生對該課程的關注度。師生共同努力與時俱進，培養“四位一體”的醫學檢驗技術專業應用型人才。

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Research on the Development of HPV Molecular Biology Test Technology

WANG Wei-fang1， LI Jia-lei1， JIA Ke-li1， HU Miao1， HE Zhi-an2

（1. Department of Medical Laboratory， Sanquan College， Xinxiang Medical University， Xinxiang， Henan 453003， China; 2. Department of Medical Laboratory， Xinxiang Medical University， Xinxiang， Henan 453003， China）

Abstract：Cervical cancer is a common cancer in adult women nowadays. In line with the principle of caring for womens health and making students skillfully learn about the “origin culprit” of cervical cancer — HPV（the human papilloma virus）， this paper takes HPV molecular biology test methods as an example， systematically combs the HPV molecular biology test technologies. Guided by the current social needs， we should add practical cases in the teaching process， enrich the teaching process， highlight the important position of the application of molecular biology test in clinical practice， improve the enthusiasm of students， establish the professional concept of testing students benevolence in the cultivation， and train “four-in-one” applied talents of medical test technology.

Key words： HPV; cervical cancer; molecular biology test technology; applied talents