大花蔥愈傷組織誘導分化及不定芽增殖研究

陳 權 陳慧蘭 張承妹 （上海孫橋現代溫室種子種苗有限公司，上海 201210）

申瑞雪 李秋靜 龐玉華 （上海上房園林植物研究所有限公司，上海 201114）

大花蔥又名吉安花，是百合科蔥屬多年生球根花卉，根鱗莖肉質，有蔥味。大花蔥原產亞洲中部，在世界各國園林綠化中多有種植，主要用于花境、巖石園或草坪旁的裝飾和美化，是同屬植物中觀賞價值較高的一種。目前，我國大花蔥的某些新優品種的種球主要依賴進口，但由于價格較貴，不宜大批量引進。大花蔥的常規繁殖依靠種子繁殖和分株繁殖，其中，種子繁殖從播種到開花所經歷的時間較長，而分株繁殖形成的子球大小不一，且繁殖速度較慢，難以滿足市場需求。因此，利用植物組織培養技術培育大花蔥種苗、種球是解決大花蔥繁殖問題的可靠途徑。但目前，有關大花蔥組織培養方面的研究國內未見報道，鑒于此，筆者對大花蔥愈傷組織誘導、分化及不定芽增殖的相關技術要點進行了研究，以期為今后建立大花蔥組培種球繁殖技術體系進行技術積累。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為大花蔥鱗球莖，由上海上房園林植物研究所有限公司提供，品種為“舒伯特”。取材時間為2020年1月。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒

選擇天氣晴好的中午，將種植在田間的大花蔥鱗球莖完整挖出，去除泥土后帶回實驗室。先將鱗球莖頂部的葉片及基部的根系剔除干凈，再將外表皮剝去，在加入洗潔精的清水中浸洗5 min，然后在流水下沖洗45 min。在超凈工作臺上先用75%酒精震蕩消毒30 s，再分別用0.05%、0.1%的升汞，分別消毒10、15、20 min，在消毒劑中加入2～3滴吐溫-20，消毒結束后用無菌水清洗5次，時間為5 min，最后用無菌紗布吸干表面水分待接種。30 d后統計外植體成活率，外植體成活率（%）=（成活數量÷接種數量）×100。

1.2.2 初代培養

將消毒后的大花蔥鱗球莖切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種在不同激素濃度及配比的MS培養基上，依據培養基配方不同共設5個處理，分別為：（1）6-BA 0.25 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L；（2）6-BA 0.25 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L；（3）6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L ；（4）6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L；（5）6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。各培養基配方均添加白砂糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH均為6.0。處理（1）、（2）、（3）、（4）采用二步法，即先暗培養3 d再轉入光照培養，10 d后均轉入MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+白砂糖30 g/L培養基中；處理（5）采用一步法，即直接在以6-BA和NAA為激素組合的培養基中誘導。光照培養條件為溫度（25±1）℃、光照時間12 h/d、光照強度3 000 Lux。30 d后統計愈傷誘導率，愈傷誘導率（%）=（出愈傷塊莖數量÷接種塊莖數量)×100。

1.2.3 分化培養

將初代培養中誘導產生的質地致密的愈傷組織塊均割，然后轉接到不同激素配比的MS培養基上，依據培養基配方不同共設4個處理，分別為：（1）6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（2）6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（3）6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（4）6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。各培養基配方均添加白砂糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH均為6.0。光照培養條件同1.2.2。30 d后統計不定芽誘導率，不定芽誘導率（%）=（出芽愈傷數量÷愈傷接種數量）×100。

1.2.4 叢芽增殖培養

將誘導產生的不定芽及致密愈傷組織接種在不同激素配比的MS培養基上，依據培養基配方不同共設5個處理，分別為：（1）6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L ；（2）6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（3）6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；（4）6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L ；（5）6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。各培養基配方均添加白砂糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH均為6.0，光照培養條件同1.2.2。30 d后統計芽增殖倍數，芽增殖倍數=繼代切割后接種數量÷繼代前芽叢數量。

2 結果與分析

2.1 不同濃度升汞和消毒時間對大花蔥外植體的消毒效果

由于大花蔥鱗球莖是直接從田間土壤中取得的，而土壤中存在各種微生物，且外植體消毒較為困難，故本試驗中采用滲透性強、消毒效果好的升汞溶液進行消毒。由表1可知，采用濃度為0.1%升汞消毒20 min的外植體無菌率最高，達70.0%，但由于消毒時間過長，部分外植體死亡，外植體成活率降低。經綜合考慮，以濃度為0.1%的升汞消毒15 min的消毒效果為最佳，外植體成活率達62.5%。

表1 不同濃度升汞和消毒時間對大花蔥外植體的消毒效果

2.2 不同激素配比對大花蔥愈傷組織誘導的影響

由表2可知，處理（1）、（2）、（3）、（4）采用二步法，即先在含2,4-D的誘導培養基中培養10 d，然后轉入不含2,4-D的培養基中，誘導率均達70%以上，而處理（5）采用一步法，即直接在以6-BA和NAA為激素組合的培養基中培養，其誘導效果較差，誘導率僅為26.7%。經綜合考慮，大花蔥愈傷組織誘導宜采用二步法，即先在以6-BA 0.5 mg/L和2,4-D 2.0 mg/L為激素組合的培養基中培養10 d，再轉入MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+白砂糖30 g/L培養基中，該方法誘導率最高，達93.3%，且形成的愈傷組織致密，后期形成顆粒狀愈傷，有利于再分化形成不定芽。

表2 不同激素配比對大花蔥愈傷組織誘導的影響

2.3 不同激素配比對大花蔥愈傷分化不定芽的影響

由表3可知，在培養基中添加較高濃度的6-BA，愈傷組織塊形成不定芽的比例較高，但隨著6-BA濃度的進一步提高，形成的不定芽形態差、葉片彎曲畸形，出現明顯的玻璃化現象。表明在愈傷組織誘導不定芽階段，過高濃度的細胞分裂素不利于形成有效的不定芽，6-BA濃度以控制在2.0 mg/L以內較為適宜。經綜合考慮，以6-BA 2.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L的激素配比，對愈傷組織分化不定芽的效果最好，不定芽誘導率達77.8%。

表3 不同激素配比對大花蔥愈傷組織分化不定芽的影響

2.4 不同激素配比對大花蔥不定芽增殖的影響

由表4可知，以在添加6-BA 3.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L的MS培養基上，不定芽的增殖倍數最高。據觀察，質地較好的愈傷組織在接種15 d后，表面逐漸產生顆粒狀突起，在接種20 d后陸續產生叢生芽，單芽接種在此培養基上也能取得很好的增殖效果，產生的叢生芽葉色濃綠、無玻璃化現象。當6-BA濃度低于2.0 mg/L時，芽增殖不明顯，增殖倍數較低；當6-BA濃度達到4.0 mg/L時，芽的增殖倍數并沒有繼續增加，反而有所降低，且芽出現畸形葉片，說明過高或過低的激素水平都不利于叢芽增殖。經綜合考慮，以6-BA 3.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L的激素配比，對不定芽的增殖效果最好，芽增殖倍數達2.65倍。

表4 不同激素配比對大花蔥不定芽增殖的影響

3 結論與討論

本試驗以大花蔥鱗球莖為外植體，對大花蔥愈傷組織誘導分化以及不定芽增殖的相關技術要點進行了研究。結果表明，大花蔥外植體消毒以濃度為0.1%的升汞消毒15 min的消毒效果較佳，外植體成活率達62.5%；大花蔥愈傷組織誘導宜采用二步法，即先在以6-BA 0.5 mg/L和2,4-D 2.0 mg/L為激素組合的培養基中培養10 d，再轉入MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+白砂糖30 g/L培養基中，其誘導率較高，達93.3%，且形成的愈傷組織致密，后期形成顆粒狀愈傷，有利于再分化形成不定芽；在愈傷組織再分化階段，過高濃度的細胞分裂素不利于形成有效的不定芽，6-BA的濃度以控制在2.0 mg/L以內較為適宜，以6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的激素配比較為適宜，不定芽誘導率達77.8%。同時，本試驗發現，在大花蔥愈傷組織分化階段，為控制玻璃苗的發生，將6-BA的濃度控制在2.0 mg/L，但經過2～3次繼代培養后，叢生芽的增殖比例明顯下降，需提高6-BA的濃度，故在大花蔥不定芽增殖階段，以6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L的激素配比，芽的增殖效果較好，增殖倍數達2.65倍?？梢?，在大花蔥組培時芽增殖過程中，應根據苗的長勢，適時調整激素配比，以獲得理想的增殖效果。