MALDI-TOF MS在人工關節置換術后病原菌快速鑒定中的價值

丁毅偉，韓志海

（解放軍總醫院第六醫學中心呼吸與危重癥醫學科，北京 100084）

隨著醫學技術的進步，越來越多的患者選擇人工關節置換，感染是手術后最嚴重的并發癥之一[1]，及時進行抗感染治療是改善患者預后的關鍵，快速、準確的病原菌鑒定意義重大。但是，關節液樣本的培養需要2～3 d，少數苛養菌和真菌的培養時間更長，甚至需要14 d；將關節液放入血培養瓶中進行增菌培養也需要至少8～12 h。采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術可快速鑒定報陽血培養樣本中的病原菌，較傳代培養之后對瓊脂上的單個菌落進行常規MALDI-TOF MS鑒定，鑒定時間可從平均24.48 h減少到1 h內[2-3]。常規MALDI-TOF MS最耗時的過程是在鑒定之前對樣本進行傳代培養。HB&L微生物培養系統（簡稱HB&L系統，意大利Alifax公司）最初被用于快速篩查尿液樣本中的病原菌，能夠快速增菌培養，采用獨特的光散射技術實時監測麥氏濃度，提示細菌生長。有研究結果表明，HB&L系統可以用于報陽血培養樣本的快速培養，聯合MALDI-TOF MS，鑒定準確率和時效性均較高，已被應用于血流感染的快速診斷[4]。但將關節液樣本置于血培養瓶中，陽性報警后，經HB&L系統前處理后直接采用MALDI-TOF MS鑒定病原菌的研究尚不多見。本研究采用MALDI-TOF MS對經HB&L系統前處理后的關節液樣本進行直接鑒定，并與常規MALDI-TOF MS鑒定、分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定、平板培養鑒定結果進行比較，評價直接MALDI-TOF MS與HB&L系統聯用在快速鑒定血培養瓶報陽關節液樣本病原菌中的價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

采用無菌方法采集解放軍總醫院第六醫學中心人工關節置換術后疑似感染患者的關節液樣本104例，分別注入需氧血培養瓶和厭氧血培養瓶各10 mL，另外3 mL關節液及時送至檢驗科行常規培養。104例關節液樣本中，99例為單一細菌感染，5例為混合菌感染。

1.2 儀器與試劑

MALDI-TOF MS儀及配套α-氰基-4-羥基肉桂酸基質液（德國Bruker公司）；甲酸、無水乙醇、乙腈（美國Sigma-Aldrich公司）；2 mL血培養瓶（意大利Alifax公司）；BacT/A lert 3D自動血液培養系統和需氧、厭氧血培養瓶（美國貝克曼庫爾特公司）；需氧血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、巧克力瓊脂平板（鄭州安圖公司）；Insepack ST740CG血清分離膠促凝管（廣州陽普公司）。

1.3 方法

1.3.1 常規MALDI-TOF MS鑒定 將已注入關節液的需氧和厭氧血培養瓶置于BacT/A lert 3D自動血液培養系統，將陽性報警關節液分別接種于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和巧克力瓊脂平板進行傳代培養，5% CO2環境下35 ℃孵育18～24 h，挑取單個菌落均勻涂布于靶板上，自然干燥后加入1 μL甲酸，干燥后加基質液1 μL，采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

1.3.2 HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定 用無菌注射器將需氧和厭氧血培養瓶中的陽性菌液抽出2 mL，吸取10 μL轉種于HB&L血培養瓶中繼代培養1～3 h，當達到1.5麥氏濃度后，從培養液中取1 mL陽性菌液置于1.5 mL的Eppondorf管中，11 346×g離心2 min，重復操作2次，取1 μL沉淀均勻涂布于MALDI-TOF MS儀靶板，自然干燥后加1 μL甲酸，干燥后加基質液1 μL，采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

1.3.3 分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定 從報陽血培養瓶中抽取3 mL菌液至Insepack ST740CG血清分離膠促凝管，600×g離心10 min，棄上清液，用無菌棉簽挑取富集在分離膠表面的細菌沉淀物，加入1 000 μL去離子水，混勻后11 346×g離心2 min，重復操作2次，棄上清，加入500 μL無水乙醇混勻，11 346×g離心2 min，棄上清，室溫環境開蓋放置2 min，取1 μL沉淀均勻涂布于MALDI-TOF MS儀靶板，晾干后加1 μL甲酸，干燥后加基質液1 μL，采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

1.3.4 平板培養 將無菌注射器收集的3 mL關節液充分混合后，分別滴加于血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和巧克力瓊脂平板，5% CO2環境35 ℃孵育18～24 h，挑取單個菌落均勻涂布于MALDI-TOFMS儀靶板，自然干燥后加1 μL甲酸，干燥后加基質液1 μL，采用MALDI-TOF MS進行細菌鑒定。

1.4 判斷標準

根據MALDI-TOF MS儀說明書要求：＞2.000分，可鑒定到種水平；1.700～1.999分，可鑒定到屬水平；≤1.700分為結果不可靠；如≤1.700分，但鑒定結果前3位均屬于同一種菌，也認為結果正確，否則為結果不可靠。

2 結果

2.1 4種方法鑒定結果比較

99例單一細菌感染樣本中，采用HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定、分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定和常規MALDITOF MS鑒定均有15例陰性，常規培養有39例陰性。血培養瓶增菌培養陽性樣本中，2種直接MALDI-TOF MS鑒定和常規MALDI-TOF MS鑒定檢出率均為84.8%（84/99），平板培養檢出率僅為60.6%（60/99）。

HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的檢出率分別為86.9%（40/46）、91.9%（34/37）。分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的檢出率分別為78.3%（36/46）、83.8%（31/37）。2種直接MALDI-TOF MS鑒定方法檢出的革蘭陽性菌以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為主，革蘭陰性菌以大腸埃希菌為主，有84株病原菌被鑒定至種水平，僅1株白念珠菌被鑒定至屬水平。HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定分別有9例和16例樣本培養出細菌，但鑒定失敗；常規MALDI-TOF MS鑒定均鑒定出細菌。平板培養檢出率低于其他3種方法，革蘭陽性菌、革蘭陰性菌檢出率分別為70.1%（35/46）、67.6%（25/37）。見表1。

表1 4種方法鑒定結果 株

2.2 4種方法病原菌鑒定不一致結果

2.2.1 HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和常規MALDI-TOF MS鑒定 有9例單數菌樣本HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗，分別是2株產酸克雷伯菌、2株溶血葡萄球菌，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、屎腸球菌、變異鏈球菌各1株；常規MALDI-TOF MS鑒定全部檢出。有5例混合菌樣本HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗，分別為1例產酸克雷伯菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌樣本，1例溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌樣本，1例溶血葡萄球菌、屎腸球菌樣本，1例科氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌樣本；1例變異鏈球菌、表皮葡萄球菌樣本；常規MALDI-TOF MS鑒定全部檢出。見表2。

表2 4種方法病原菌鑒定不一致結果

續表2

2.2.2 HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和平板培養 有9例單數菌樣本HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗。這9例樣本中，平板培養鑒定出溶血葡萄球菌和科氏葡萄球菌各1株，其他7例樣本未見菌株生長。2例混合菌樣本平板培養均鑒定出病原菌，1例為產酸克雷伯菌、屎腸球菌和表皮葡萄球菌混合菌樣本，1例為溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌混合菌樣本；這2例混合菌樣本HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定均未檢出病原菌。見表2。

2.2.3 HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定和分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定 HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定檢出少動鞘氨醇菌、洋蔥伯克霍爾德菌、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌、緩癥鏈球菌、變異鏈球菌、丙酸桿菌各1株，但分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定未檢出病原菌。5例混合菌樣本2種直接MALDI-TOF MS鑒定均未檢出病原菌。見表2。

2.2.4 常規MALDI-TOF MS鑒定和平板培養 2種方法對2株葡萄球菌的鑒定結果一致，分別是溶血葡萄球菌和科氏葡萄球菌。常規MALDITOF MS鑒定生長但平板培養未生長的菌株主要為產酸克雷伯菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、科氏葡萄球菌和變異鏈球菌。5例混合菌樣本中，有2例2種方法鑒定結果一致，其他3例平板培養未見菌落生長。見表2。

2.3 4種方法檢出時間比較

常規MALDI-TOF MS鑒定、平板培養、分離膠富集細菌后直接MALDI-TOFMS鑒定、HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定4種方法檢出時間分別為45.2 、54.3、9.4、10.2 h。HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定均在14 h內檢出微生物，其中11例樣本7 h內即檢出微生物，見表3。

表3 不同時間HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定結果

3 討論

本研究結果表明，HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS可鑒定出血培養瓶報陽關節液樣本中與常規轉種法鑒定結果相似的微生物，且耗時大大縮短。該方法病原菌鑒定率低于常規MALDI-TOF MS，有9例未鑒定出微生物，高于分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS法和平板培養法，且鑒定時間大大縮短，對于關節置換術后人工關節感染患者的抗感染治療有積極意義，有利于改善患者預后。

本研究中，HB&L系統處理后直接MALDITOF MS在關節液陽性血液培養物中鑒定出91.9%（34/37）的革蘭陰性菌和86.9%（40/46）的革蘭陽性菌，與之前報道的血流感染直接MALDI-TOF MS鑒定結果一致，即直接MALDITOF MS鑒定對革蘭陰性菌具有較高的鑒定率，對于革蘭陽性菌的鑒定率次之[5-8]，原因可能是革蘭陽性菌的細胞壁更堅固，降低了蛋白質提取率，使MALDI-TOF MS鑒定受到影響[9-10]。HB&L系統處理后直接MALDI-TOF MS鑒定對10.7%（9/84）的關節液陽性血液培養物鑒定失敗（其中50%是革蘭陽性球菌），但比分離膠富集細菌后直接MALDI-TOF MS鑒定失敗率[19.0%（16/84）]低，而常規MALDI-TOF MS鑒定成功鑒定出培養物中的所有病原菌。本研究中，常規MALDI-TOF MS鑒定出5例多種菌混合感染樣本，但是2種直接MALDI-TOF MS均未鑒定出，原因可能是MALDI-TOF MS鑒定混合菌樣本時，會產生異常或多樣的蛋白質譜，使MALDI-TOF MS無法從其數據庫中識別出每個微生物。

用血培養瓶對人工關節置換術后關節液進行培養，通常需要3～5 d才能鑒定出病原菌[11-12]，無法滿足臨床需求。如果可以較早地鑒定出病原菌，可以更精確地進行有針對性的經驗治療，以減少耐藥菌株的產生。采用MALDI-TOF MS直接鑒定關節液陽性血液培養物具有可快速鑒定病原菌的優勢。有研究結果表明，直接采用MALDI-TOF MS鑒定陽性血液培養物需7.1 h，比常規方法的48.1 h明顯縮短[13]。在本研究中，直接MALDI-TOF MS關節液陽性血液培養物病原菌鑒定時間為5～14 h，明顯低于常規MALDI-TOF MS鑒定的45.2 h和常規培養的54.3 h。

綜上所述，直接MALDI-TOF MS可快速鑒定人工關節置換術后感染患者關節液樣本中的單個病原菌，聯合HB&L系統，能夠在3 h之內提供MALDI-TOF MS所需的菌液沉淀物，大大縮短了鑒定時間，一旦直接MALDI-TOF MS鑒定出病原菌，臨床就可在1 d內有針對性地進行經驗治療[8]。

本研究不足之處在于僅收集到1株真菌，雖然3種方法均培養出真菌，但采用直接MALDITOF MS鑒定對真菌的檢出率較低，與相關文獻報道一致[14]，后續將擴大樣本量進一步分析。另外，3種方法均無法進行抗菌藥物敏感性分析，若能進一步提供快速的藥物敏感性試驗報告，將更加有利于指導臨床用藥[15-16]。