HPLC 法同時測定金水咳喘康膠囊中4 種成分

顧崇梅，郭華榮，李 瑤，陳慧潔

（酒泉市藥品檢驗檢測中心，甘肅 酒泉 735000）

金水咳喘康膠囊由黃芪、人參、肉桂、蛇床子、當歸、沙參等13 味中藥組成，長期服用可降低患者秋冬季慢性支氣管炎發作次數、時間、程度，療效理想，方中蛤蚧、人參、黃芪、蛇床子、金櫻子、肉桂功效補肺益腎，納氣定喘，貝母、黃精、百合功效潤肺健脾、止咳化痰，地龍、水蛭、當歸功效活血逐瘀、滌清頑痰伏飲，但目前其質量標準僅停留在顯微鑒別和貝母甲素、貝母乙素TLC鑒別上，不能全面反映其內在質量。本實驗選擇金水咳喘康膠囊君藥黃芪、當歸、肉桂、蛇床子中的主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷［1-3]、阿魏酸［4-6]、桂皮醛［7-8]、蛇床子素［9]作為指標，通過HPLC 法同時測定四者含量，以期為該制劑質量控制提供基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Waters e2695，配置DAD 檢測器（美國Waters 公司）；MS205DU 電子天平［梅特勒托利多儀器（上海）有限公司]；KH-250DB 超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201505，純度97.1%）、阿魏酸（批號110773-201915，純度99.4%）、桂皮 醛（批號110710-201217，純度99.5%）、蛇床子素（批號110822-201710，純度99.5%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。金水咳喘康膠囊由酒泉市中醫院提供，陰性樣品為自制。乙腈為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇為分析純（天津化學試劑廠）；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent 5 HC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.086%磷酸（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm（0～16 min）、303 nm（16～20 min）、322 nm（20～25 min）、303 nm（25～33 min）；進樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為2.005 6、5.017 5、50.231 2、6.112 2 mg/mL 的貯備液，甲醇定容至刻度，即得（各成分質量濃度分別為0.100 3、0.501 8、5.023 1、0.305 6 mg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 將膠囊去除囊殼，取內容物約6 g（相當于樣品20 粒），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 甲醇，稱定質量，浸泡過夜后超聲（350 W、50 kHz）處理1 h，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 根據處方及制劑工藝，分別制備缺黃芪、缺當歸、缺肉桂、缺蛇床子的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液各20 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，供試品溶液中各成分均在對照品溶液相同保留時間處有色譜峰，分離度均大于1.5，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關系考察 精密量取對照品溶液2、4、6、10、16、10 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積積分值為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of variouis constituents

2.3.3 檢測限、定量限考察 以S/N=3 為檢測限，S/N=10 為定量限，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素檢測限分別為0.930 1、0.220 1、0.180 3、1.170 1 ng，定量限分別為3.100 3、0.733 7、0.601 1、3.900 3 ng。

2.3.4 耐用性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素峰面積RSD 分別為2.19%、2.05%、1.85%、1.98%，保留時間RSD 分別為0.23%、0.18%、0.35%、0.41%，表明該方法耐用性良好。

2.3.5 中間精密度試驗 取同一份供試品溶液，采用Agilent 1260、Waters e2695 色譜儀，以及Agilent 5 HC-C18、Waters Symmetry C18、InertSustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素含量RSD，結果見表3，可知該方法中間精密度良好。

表3 各成分中間精密度試驗結果Tab.3 Results of intermediate precision tests for various constituents

2.3.6 重復性試驗 取同一批膠囊，按“2.2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素含量RSD 分別為2.28%、1.82%、1.99%、2.15%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素含量RSD 分別為2.68%、2.11%、2.10%、2.35%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取同一批膠囊6 份，精密加入“2.2.1”項下對照品溶液（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素質量濃度分別為0.501 4、0.301 1、0.803 7、2.139 3 mg/mL）各1 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.4 樣品含量測定 取6 批膠囊，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，平行2 次，結果見表5。

表5 各成分含量測定結果Tab.5 Results of content determination of various constituents

3 討論

3.1 流動相選擇 本實驗分別對甲醇-0.1%醋酸、乙腈-水、乙腈-0.086%進行梯度洗脫，發現前兩者均不能同時檢測出毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素，而乙腈-0.086%磷酸可以，并且達到了完全分離的效果，故選擇其作為流動相。

3.2 檢測方法選擇 金水咳喘康膠囊藥味多，組成復雜，單波長、多波長均無法有效排除不同成分之間的干擾，故本實驗采用波長轉換法［10-16]進行測定，效果理想。

3.3 檢測波長選擇 本實驗采用DAD 檢測器，對供試品、陰性樣品溶液在190～400 nm 范圍內進行全波長掃描，發現毛蕊異黃酮葡萄糖苷在200、260 nm處有最大吸收，其中260 nm 處響應值比較大，故確定為260 nm；阿魏酸在322 nm 處有最大吸收，同時在303 nm 處吸收也很大，而且色譜峰峰形更尖銳對稱，故確定為303 nm；桂皮醛在190～340 nm 處均有吸收，雖然290 nm 處吸收最大，但322 nm 處陰性干擾最小，故確定為322 nm；蛇床子素在303、322 nm 處均有最大吸收，其中303 nm 處陰性干擾最小，故確定為303 nm。

4 結論

本實驗首次建立HPLC 法同時測定金水咳喘康膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素的含量，該方法操作簡便，結果準確，方法穩定，重復性好，可作為該制劑質量評價和控制的依據。