紫蘇葉化學成分及其體外抗炎活性

王宇寧樊 暉梁克利

（1.沈陽市第七人民醫院，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110847；3.哈爾濱商業大學，黑龍江 哈爾濱 150076）

紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.為唇形科紫蘇屬植物，具有較高的食用及藥用價值，在我國應用歷史悠久，紫蘇葉可做香料使用，紫蘇種子油可供食用，也可用于工業防腐用途［1]，我國資源豐富，華北、華中、華南、西南及臺灣省均有野生種和栽培種，印度、緬甸、日本、朝鮮、韓國、印度尼西亞、俄羅斯等國家均有分布［2]，具有宣肺化痰、解表散寒、行氣和胃等功效，傳統臨床常用于胃炎、支氣管炎、以及腎炎等炎癥性疾病的治療［3]。目前關于紫蘇葉的抗炎作用尤其是治療潰瘍性結腸炎的作用越來越得到重視，現代藥理學研究表明其提取物抗炎作用與抑制炎癥介質釋放、調控活性氧簇一氧化氮水平等機制有關［4]，它含有豐富的揮發油、酚酸、黃酮等成分，被認為是其主要的抗炎活性物質［5-7]。因此，本課題組在相關文獻基礎上進一步對紫蘇葉的化學成分進行分離純化，并以RAW264.7 細胞為評價模型，采用Western-blot 法檢測化合物對iNOS 及COX-2 等相關蛋白表達的影響，初步對其抗炎活性進行評價。

1 材料

Bruker-400 核磁共振儀（德國Bruker 公司，內標TMS）；Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，UV 檢測器）；電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；全自動化學發光成像分析儀（上海天能科技有限公司）；柱色譜用硅膠（青島海洋化工廠）；大孔吸附樹脂D101 填料（滄州寶恩樹脂科技有限公司）；ODS 填料（美國Welch公司）。DMSO（美國Sigma 公司）；Peroxidaseconjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit 及Anti-β-actin（美國Proteintech 公司）；P-Tau Rabbit mAb（美國Cell Signaling Technology 公司）；Tau Rabbit mAb（英國Abcam 公司）；Marker（上海信裕生物科技有限公司）；細胞裂解液、PMSF、ECL 發光液等（上海碧云天生物技術有限公司）；TEMED 及PVDF 膜（沈陽鼎國生物技術有限公司）；RAW264.7 細胞株（美國ATCC 公司）。紫蘇葉購自遼河大藥房，由沈陽市第七人民醫院王宇寧中藥師鑒定為紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.干燥葉。甲醇等溶劑均購自于天津大茂化學試劑有限公司。

2 提取與分離

紫蘇葉干燥全草15 kg 粉碎后，采用8 倍量75%乙醇回流提取2 次，每次2 h，提取液合并后減壓濃縮至無醇味，得到提取物浸膏2.3 kg，蒸餾水溶解后用D101 大孔吸附樹脂進行分離，以乙醇-水（0～100%）梯度洗脫，60%洗脫部分經正相硅膠柱，二氯甲烷-甲醇（100∶0～1∶1）梯度洗脫，取20∶1 洗脫部分進行分離，經ODS 反相柱，分別采用10%、30%、50%、70%、100% 甲醇-水洗脫，進一步采用半制備型HPLC，以甲醇-水洗脫純化，其中10% 部分經過純化分離，得化合物1；30%部分經過純化分離，得到化合物2～4、5、6～7。

3 結構鑒定

化合物1：白色無定形粉末。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）中顯示δH1.15（3H，d，J=6.3 Hz，H-10），1.10（3H，s，H-13），1.01（3H，s，H-12），0.73（3H，s，H-11）提示為4 個甲基上的氫信號，δH5.69（1H，dd，J=15.9，0.9 Hz，H-7），5.68（1H，dd，J=15.9，5.9 Hz，H-8）為一組反式雙鍵上的氫信號。 δH1.50（1H，d，J=12.0 Hz，H-2），1.27（1H，dd，J=12.0，3.0 Hz，H-2）和δH1.59（2H，m，H-4）為兩組亞甲基上的氫信號；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）中顯示δC27.3，27.1，26.0，24.8 提示為4 個甲基碳信號，δC135.1，129.2 為一組雙鍵上的碳信號。以上數據與文獻 ［8] 基本一致，故鑒定為（3R，5S，6S，7E，9S）-megastiman-7-ene-3，5，6，9-tetrol。

化合物2：無色油狀物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：6.92（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），6.78（1H，d，J=1.9 Hz，H-3′），6.66（1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H-5′），4.44（2H，m，H-9′），4.06（1H，m，H-2），3.72（3H，s，2′-OCH3），3.54（2H，m，H-1），3.54（2H，m，H-3），2.62（2H，m，H-7′），1.68（2H，m，H-8′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6） δ：60.4（C-1），81.5（C-2），60.4（C-3），145.7（C-1′），150.0（C-2′），116.6（C-3′），135.7（C-4′），120.3（C-5′），113.1（C-6′），31.5（C-7′），34.7（C-8′），60.5（C-9′），55.7（2′-OCH3）。以上數據與文獻 ［9] 基本一致，故鑒定為 2-［4-（3-hydroxypropyl）-2-methoxyphenoxy] propance-1，3-diol。

化合物3：黃色油狀物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：6.97（1H，d，J=8.2 Hz，H-6′），6.79（1H，d，J=1.8 Hz，H-3′），6.67（1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-5′），4.29（1H，m，H-2），4.29（2H，m，H-9′），4.19（1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），4.05（1H，m，H-6″），3.92（1H，m，H-5″），3.88（2H，m，H-3），3.73（3H，s，2′-OCH3），3.63（1H，m，H-4″），3.59（1H，m，H-3”），3.58（1H，m，H-6″），3.57（2H，d，J=11.1 Hz，H-1），3.28（1H，m，H-2″），2.53（2H，m，H-7′），1.69（2H，m，H-8′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：68.0（C-1），78.9（C-2），60.1（C-3），145.1（C-1′），149.6（C-2′），116.1（C-3′），135.6（C-4′），120.0（C-5′），112.8（C-6′），31.3（C-7′），34.5（C-8′），60.2（C-9′），55.5（2′-OCH3），103.5（C-1″），73.4（C-2″），76.7（C-3″），70.0（C-4″），76.9（C-5″），61.0（C-6″）。以上數據與文獻 ［10] 基本一致，故鑒定為 1-O-（β-Dglucosyl）-2-［2-methoxy-4-（-hydroxypropyl）-phenoxy] -propan-3-ol。

化合物4：黃色油狀物（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：6.38（1H，brs，H-2′），6.63（1H，brs，H-2），6.38（1H，brs，H-6′），6.15（1H，brs，H-5），4.62（1H，d，J=8.0 Hz，H-7′），3.78（2H，m，H-9），3.74（3H，s，3-OCH3），3.72（3H，s，3′-OCH3），3.72（3H，s，5′-OCH3），2.72（2H，m，H-7），3.20（2H，m，H-9′），2.18（1H，m，H-8′），1.68（1H，t，J=8.4 Hz，H-8）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6） δ：132.7（C-1），112.0（C-2），145.7（C-3），144.3（C-4），116.3（C-5），127.3（C-6），32.4（C-7），38.3（C-8），63.8（C-9），136.3（C-1′），106.9（C-2′），148.0（C-3′），134.0（C-4′），148.0（C-5′），106.9（C-6′），49.0（C-7′），46.4（C-8′），60.0（C-9′），55.7（3-OCH3），56.2（3′-OCH3），56.2（5′-OCH3）。以上數據與文獻 ［11] 基本一致，故鑒定為 5-methoxyisolariciresinol。

化合物5：黃色油狀物（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：7.00（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.84（1H，brs，H-2），6.84（1H，brs，H-2′），6.72（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.70（1H，brd，J=8.0 Hz，H-6），6.70（1H，d，J=8.0 Hz，H-6′），4.85（1H，d，J=7.3 Hz，H-7），4.67（1H，d，J=6.8 Hz，H-1″），3.87（1H，m，H-9′），3.76（6H，s，3，3′-OCH3），3.68（2H，m，H-9），3.62（1H，m，H-6″），3.57（1H，m，H-9′），3.47（1H，m，H-6″），3.26（1H，m，H-3″），3.25（1H，m，H-5″），3.20（1H，m，H-4″），3.17（1H，m，H-7′），3.12（1H，m，H-2″），2.88（1H，m，H-8′），2.61（1H，m，H-7′），2.47（1H，m，H-8）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6） δ：134.9（C-1），110.2（C-2），149.0（C-3），145.7（C-4），115.6（C-5），118.4（C-6），82.0（C-7），52.5（C-8），58.8（C-9），134.9（C-1′），113.3（C-2′），147.4（C-3′），145.0（C-4′），115.2（C-5′），120.6（C-6′），32.4（C-7′），42.0（C-8′），72.0（C-9′），55.8（3，3′-OCH3），100.6（C-1″），73.4（C-2″），77.2（C-3″），69.9（C-4″），77.0（C-5″），60.9（C-6″）。以上數據與文獻［12] 基本一致，故鑒定為lariciresinol 4′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物6：白色結晶（甲醇）。1H-NMR（CDCl3）譜中的δH7.99 和δH6.91 顯示各有2 個氫存在，分別被鄰位、間位相互偶合裂分為dd 峰，表明苯環為對位取代；由13C-NMR 和1H-NMR 可知該化合物含有苯環，1 個甲基，4 個亞甲基，3 個次甲基，3 個季碳。以上數據與文獻［13] 基本一致，故鑒定為butyl p-hydroxybenzoate。

化合物7：黃綠色無定形粉末。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：8.10（1H，s，H-7），7.65（1H，s，H-8′），7.46（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），7.25（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），7.24（1H，s，H-6′），6.60（1H，s，H-3′）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6） δ：123.2（C-1），123.2（C-2），136.2（C-3），141.1（C-4），119.8（C-5），121.3（C-6），127.3（C-7），127.2（C-8），167.7（C-9），110.2（C-1′），145.0（C-2′），104.0（C-3′），148.2（C-4′），142.7（C-5′），108.3（C-6′），126.6（C-7′），110.9（C-8′）。以上數據與文獻［14] 基本一致，故鑒定為mongolicumin A。

4 抗炎活性篩選

將RAW264.7 細胞培養與DMEM 培養基中（含有10% FBS），細胞按每孔8×104/0.5 mL 濃度接種至24 孔板內，孵育24 h。待測化合物（DMSO 溶解，終濃度為80 μmol/L）及陽性藥10 μg/mL地塞米松（DEX）預處理1 h 后，脂多糖（LPS，質量濃度為100 ng/mL）刺激18 h。再提取細胞總蛋白，用于iNOS 和COX-2 蛋白的電泳及檢測。

結果顯示，經LPS 刺激后iNOS 和COX-2 蛋白表達明顯增強，提示造模成功。DEX 在10 μg/mL質量濃度下可顯著抑制iNOS、COX-2 蛋白表達，而化合物2可顯著抑制iNOS 蛋白表達，提示它有一定的抗炎活性。見圖1。

圖1 各化合物對RAW264.7 細胞中iNOS、COX-2蛋白表達的影響Fig.1 Effects of various compounds on protein expressions of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells model

5 結論

誘導型iNOS 是利用一氧化氮的氧化應激，協助巨噬細胞在免疫系統中對抗病原體的一類酶。其在細胞受到刺激而被激活后才發揮功效，并且所生成的一氧化氮數量較多。COX 又稱前列腺素過氧化物合成酶，是前列腺素（PG）合成過程中一個重要的限速酶，可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產物，從而在機體的生理和病理過程中發揮作用。以上兩者均為重要的炎癥介質，其表達程度可以作為炎癥的判斷標準。

本研究對紫蘇葉乙醇提取物中化學成分進行系統分離純化，得到7 個化合物，并對分離得到的各單體化合物體外抗炎活性進行初步評價。其中化合物2在80 μmol/L 時可以顯著的抑制iNOS 的蛋白表達，顯示出一定的抗炎活性。以期該研究為紫蘇葉開發應用提供部分前期工作基礎。