UHPLC 法同時測定馬蘭草中10 種成分

黃 雯，洪 靜，劉亞平，葉喜德*，彭玲珍*

（1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.上海市奉賢區中心醫院，上海 201400；3.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330004）

馬蘭草Kalimeris indica L.為菊科馬蘭屬植物，全草可入藥，在我國大部地區均有分布，尤其是在貴州，民間又名田邊菊、路邊菊、雞兒腸、魚鰍串等［1]，富含多種維生素、礦物質、氨基酸等，營養價值較高，具有清熱利濕、理氣消食、解毒消腫的功效，水煎劑可用于治療胃脘脹痛、感冒咳嗽等疾病［2]，其成分包括三萜類鞣質類、酚酸類、黃酮類、甾體類等［3-5]，具有抗炎、抗氧化等作用［6-7]。目前，有部分中成藥（如馬蘭感寒膠囊、感清糖漿等）以馬蘭草為原料生產，在2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》 中其質量控制方法比較簡單，無含量測定項，一定程度上限制了其應用推廣。目前，相關報道大多數停留在單一成分或某一類成分的測定［8-12]，而多成分含量測定的盛行對控制藥材及其相關產品起導向性作用［13-16]。因此，本實驗建立UHPLC 法同時測定馬蘭草中10 種成分，以期為該藥材質量控制及應用推廣提供參考。

1 材料

LC-30AD 型高效液相色譜儀、AUW220D 型電子天平（十萬分之一，日本島津公司）；BS-224S型電子天平（萬分之一，德國Sartorius 公司）；KQ250-DB 型數控超聲波清洗器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；KQ-5200 型水浴鍋（昆山市超聲儀器有限公司）。

綠原酸（批號110753-201817，純度96.8%）、木犀草苷（批號111720-201810，純度93.5%）、木犀草素（批號111520-202006，純度94.4%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。新綠原酸（批號20180911，純度98.7%）、隱綠原酸（批號20170611，純度99.2%）、木犀草素-7-O-蕓香糖苷（批號20171031，純度98.6%）、異綠原酸A（批號20180921，純度99.5%）、異綠原酸B（批號20181123，純度99.8%）、異綠原酸 C（批號20180511，純度99.5%）、大波斯菊苷（批號20180313，純度98.5%）對照品均購于成都曼思特生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。馬蘭草共24 批，由江西中醫藥大學中藥鑒定教研室胡生福副教授鑒定為正品，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備 取藥材粉末（過4 號篩）1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 70%甲醇，稱定質量，回流提取30 min，冷卻，70% 甲醇補足減失的質量，濾過，濾液經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，加甲醇制備成每1 mL分別含新綠原酸0.013 8 mg、綠原酸0.091 2 mg、隱綠原酸0.018 0 mg、木犀草苷0.027 6 mg、木犀草素-7-O-蕓香糖苷0.018 0 mg、異綠原酸B 0.028 8 mg、異綠原酸A 0.109 8 mg、大波斯菊苷0.027 6 mg、異綠原酸C 0.048 0 mg、木犀草素0.002 4 mg 的溶液，即得。

2.3 色譜條件 Welch-C18色譜柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-0.3% 冰醋酸（B），梯度洗脫（0～6 min，3%～15% A；6～13 min，15% A；13～15 min，15%～17% A；15～18 min，17%～18% A；18～22 min，18%～19% A；22～25 min，19%A；25～30 min，19%～29%A；30～35 min，29%～49% A；35～36 min，49%～80% A；36～38 min，80%A；38～39 min，80%～3%A；39～41 min，3%A；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長326 nm；進樣量4 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下對照品溶液，溶劑稀釋至不同倍數后在“2.3”項條件下分析。以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取對照品溶液，在“2.3”項條件下進樣6 次，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、木犀草素峰面積RSD 分別為0.46%、1.01%、0.45%、1.20%、1.13%、0.76%、0.42%、1.50%、1.04%、1.42%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取樣品（S12），按“2.1”項下方法制備供試品溶液，于室溫0、2、4、8、12、24 h 在“2.3”項條件下進樣，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、木犀草素峰面積RSD 分別為0.32%、1.31%、0.29%、1.24%、1.17%、0.56%、1.82%、0.72%、1.48%、1.60%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取樣品（S2），按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣，測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、木犀草素峰面積RSD 分別為1.43%、1.67%、1.42%、1.29%、1.01%、1.26%、1.04%、1.47%、1.62%、1.58%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的樣品0.5 g，共6 份，按100% 水平加入各對照品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣，計算回收率。結果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、木犀草素回收率（RSD）分別為98.20%（1.61%）、99.20%（0.51%）、99.25%（2.13%）、99.71%（0.58%）、99.95%（0.77%）、99.65%（0.57%）、99.61%（0.41%）、100.35%（1.22%）、99.91%（0.53%）、101.00%（0.78%）。

2.9 樣品含量測定 取24 批樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下分析，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果（mg/g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3 討論

本研究根據前期預實驗發現，甾體類（如α-菠甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷）和生物堿類（如金色酰胺醇）成分，采用液相色譜方法進行定量發現，色譜峰未出現目標化合物，可能由于單一成分含量過低或者由于樣品處理方法、流動相選擇而導致無法檢測。本研究采用UHPLC 法對馬蘭草多成分含量進行測定，該方法簡單、準確性好。同時對不同來源的樣品進行含量測定，在測定的10 種成分中，發現總酚酸的含量要高于總黃酮，且單成分異綠原酸A 的含量，在所有批次中平均含量最高，其次為綠原酸。馬蘭草是一種藥食兩用植物，具有抗炎抗氧化等作用，酚酸和黃酮類化合物往往都具有此功效，測定馬蘭草中酚酸和黃酮化合物的含量，以期對于日后評價量效關系，進一步拓展和推廣馬蘭草的使用提供參考。