天南星炮制成膽南星的“減毒改性”作用

單麗倩，劉曉峰，崔亞晨，劉 悅，高 慧

（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600）

天南星是天南星科植物天南星Arisaema erubescens（Wall.）Schott.、異葉天南星Arisaema heterophyllum Blume.或東北天南星Arisaema amurense Maxim.的干燥塊莖，有溫化寒痰、祛風止痙之功效。膽南星為制天南星細粉與牛、羊或豬膽汁經加工而成，或為生天南星細粉與牛、羊或豬膽汁經發酵加工而成［1]，長于清熱化痰、息風定驚，多用于痰熱咳嗽、急驚風、癲癇等癥。天南星經發酵后制成膽南星，是炮制對改變藥性最典型的例子，性由溫轉涼，味由辛轉苦，功效由溫化寒痰轉為清化熱痰，且毒性降低。

關于膽南星的炮制作用，歷代本草學著作中多有記載，如“天南星為燥痰之品，制以牛膽以殺其毒。得牛膽則燥性減，且膽有益肝膽之功”［2]、“膽南星……降痰因火動如神，治小兒急驚必用……較之南星味苦性涼，故善解風痰熱滯……”［3]等。在現代研究中，有人基于小鼠生理生化指標對天南星、膽南星的藥性變化進行探討［4]，另有實驗證明天南星具有顯著毒性［5]，但未見對天南星、膽南星傳統藥效和毒性的系統對比研究。本課題組前期對膽南星中化學成分進行了對比研究［6]，并對發酵前后的膽酸類成分含有量進行了比較，證明了發酵后結合型膽酸轉化為游離型膽酸，確立了膽南星的發酵工藝，并建立了用3 種游離型膽酸含有量評價膽南星質量的標準［7]。本實驗圍繞膽南星的傳統功效，分別從抗高熱驚厥、清熱以及毒性三個方面，對天南星發酵前后的藥效、毒性進行對比研究，以從傳統藥效學方面驗證天南星發酵“減毒改性”的炮制理論，為進一步研究天南星的炮制原理提供基礎。

1 材料

1.1 儀器 恒溫恒濕培養箱（HWS-080 型，上海精宏實驗設備有限公司）；HZ-A6002 型電子天平（HZ-A6002 型，瑞安市金訊貿易有限公司監制）；酶標儀（MuLtiskan Mk3型，上海賽默飛世爾儀器有限公司）；醫用離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

1.2 藥物及試劑 東北天南星采自遼寧省本溪市，經遼寧省藥品檢驗檢測院王維寧教授鑒定為天南星科植物東北天南星Arisaema amurense Maxim.的干燥塊莖，采后凈制，洗去泥沙并切制成2～3 mm 厚片，晾干，即得。豬膽汁購于大連礎明集團有限公司。大鼠前列腺素E2（PGE2）試劑盒（生產批號 BPE35446）、大鼠鈉鉀ATP酶（Na+/K+ATPase）試劑盒（批號BPE30580）、大鼠琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒（批號 BPE30230）、大鼠肝糖原（Glycogen）試劑盒（批號20171116HE）、大鼠白細胞介素-1 β（IL-1β）試劑盒（批號BPE30419）、大鼠白細胞介素-6（IL-6）試劑盒（批號BPE30666）購自上海朗頓生物科技有限公司；干酵母粉（產品標準代號GB/T20886，湖北安琪酵母股份有限公司）；PBS（批號P1020-500，北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 動物 SPF 級21 日齡雄性SD 大鼠48 只（體質量60～80 g）；SPF 級雄性SD 大鼠32 只（體質量180～220 g）；SPF 級KM 小鼠80 只，雌雄各半（體質量18～22 g），均購自遼寧長生生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（遼）2017-0001，飼養于遼寧中醫藥大學SPF 級動物房。本實驗所進行的所有相關操作均在遼寧中醫藥大學動物倫理委員會的批準下進行，批準號2018YS（DW）-043-01。

1.4 樣品制備 天南星鮮品：取天南星塊莖，洗去泥沙，即得。天南星：取天南星塊莖，洗去泥沙，切制成2～3 mm厚片，晾干，即得。膽南星：取天南星細粉過五號篩，加入凈膽汁（經絹布濾過），經1∶1 比例混合，置32 ℃、80%的恒溫恒濕培養箱中發酵15 d 取出，至蒸制容器中蒸1 h 至透，趁熱切成1.5～2 cm 的小塊，曬至黑褐色，即得［7]。

2 方法

2.1 樣品水煎液制備 抗驚厥實驗用藥：取適量天南星、膽南星，用10 倍量水回流提取3 次，濃縮制成中劑量（0.14 g 生藥/mL）、高劑量（0.28 g 生藥/mL）水煎液。解熱實驗用藥：取適量天南星、膽南星，用10 倍量水回流提取3 次，濃縮制成0.28 g 生藥/mL 水煎液。毒性實驗用藥：取適量天南星搗碎，加水制成低劑量（0.18 g 生藥/mL）、中劑量（0.25 g 生藥/mL）、高劑量（0.32 g 生藥/mL）溶液；天南星、膽南星用10 倍量水回流提取3 次，濃縮制成低劑量（0.18 g 生藥/mL）、中劑量（0.25 g 生藥/mL）、高劑量（0.32 g 生藥/mL）水煎液。

2.2 抗驚厥實驗 取48 只21 日齡SD 大鼠適應性飼養1周，隨機分為6 組，每組8 只，分別為空白組、模型組以及天南星中、高劑量組和膽南星中、高劑量組。給藥組大鼠按1.4、2.8 g 生藥/kg 劑量灌胃給藥，空白組、模型組給予等容量生理鹽水，連續7 d。于第7 天灌胃給藥后1 h后測肛溫，參照周國平等［8]建立的45 ℃熱水浴誘發的大鼠驚厥模型，將除空白組外其余各組大鼠置于（45±2）℃熱水浴中，誘發驚厥發作，驚厥發生后立即從水中撈出大鼠。觀察各組大鼠驚厥發生數、驚厥死亡數、驚厥潛伏期（從進入熱水浴至驚厥發作的時間）、驚厥持續時間和驚厥誘發結束時肛溫并計算驚厥發生率、驚厥致死率和肛溫上升速度，肛溫上升速度=（驚厥誘發結束時肛溫-驚厥誘發開始時肛溫）/驚厥潛伏期，規定驚厥最大觀察時間為5 min［9]。

2.3 解熱實驗 取32 只SD 大鼠適應性飼養1 周，于正式實驗前3 天在每日上午9 時測定大鼠體溫，選取體溫在36.6～38.3 ℃之間、正常波動小于0.2 ℃的大鼠作為正常實驗大鼠，末次測量體溫之后隨機將大鼠隨機分為4 組，每組8 只，分別為空白組、模型組、天南星組、膽南星組。給藥組大鼠按2.8 g 生藥/kg 劑量灌胃給藥，空白組、模型組給予等體積生理鹽水，連續7 d。于給藥第7 天，分別測量晨起肛溫，空白組皮下注射生理鹽水，其余組均按10 mL/kg劑量皮下注射20% 干酵母混懸液造模［10]。造模30 min后，各組灌胃相應藥物，空白組和模型組給予生理鹽水，測量給藥后0、1、2、3、4、5、6 h 的肛溫，并于末次測量后，用乙醚麻醉大鼠，斷頭處死，隨后立即在冰浴中取腦，切取下丘腦組織并加PBS 溶劑勻漿置冷凍室內保存，測定各給藥組下丘腦組織中前列腺素E2（PGE2）的水平；取肝組織并稱重，切取部分肝組織加PBS 溶劑勻漿后置冷凍室內保存，測定各給藥組肝臟組織中鈉鉀ATP 酶（Na+/K+ATPase）、琥珀酸脫氫酶（SDH）以及肝糖原（Glycogen）的水平；腹主動脈取血，置于EP 管中，3 800 r/min離心20 min，吸取血清上清液，測定各給藥組血清中炎癥因子白胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1 β（IL-1 β）的水平。

2.4 毒性實驗 SPF 級KM 小鼠80 只，體質量（20±2）g，雌雄各半，按體質量和性別隨機分為10 組，每組8 只，分別為空白組，天南星鮮品高、中、低劑量組及天南星高、中、低劑量組和膽南星高、中、低劑量組，受試動物實驗前禁食不禁水12 h，空白組灌胃等體積生理鹽水，給藥組按1.8、2.5、3.2 g 生藥/kg 劑量灌胃給藥2 次，時間間隔為12 h。灌胃后各組小鼠自由攝取標準鼠糧，自由飲水，密切觀察小鼠的行為活動、精神狀態、攝食飲水、皮毛光澤、糞便尿液、呼吸情況、鼻、眼、口腔有無異常分泌物等情況，并記錄小鼠死亡情況。

2.5 統計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行分析，數據以（）表示，各組數據采用單因素方差分析與組間t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 天南星發酵前后抗高熱驚厥作用結果 與模型組相比，除天南星高劑量組外，各給藥組均能夠降低幼齡SD大鼠由高熱引起的驚厥發生率，且天南星高劑量組具有一定的致死率，可能與天南星具有毒性有關；與天南星組相比，高劑量膽南星組能顯著降低驚厥發生率，在同樣發生驚厥的中劑量組中，膽南星組能夠明顯降低驚厥發生率，縮短驚厥持續時間，降低肛溫上升速度，說明天南星經發酵炮制后可明顯增強抗高熱驚厥作用。見表1。

表1 各組藥物對幼齡SD 大鼠驚厥發生率、驚厥致死率、驚厥潛伏期、驚厥持續時間以及肛溫上升速度的影響（，n=8）

表1 各組藥物對幼齡SD 大鼠驚厥發生率、驚厥致死率、驚厥潛伏期、驚厥持續時間以及肛溫上升速度的影響（，n=8）

注：-代表未驚厥。與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；中劑量天南星發酵前后比較，＃＃P＜0.01；天南星中、高劑量組比較，aaP＜0.01。

3.2 天南星發酵前后解熱作用結果

3.2.1 天南星發酵前后肛溫變化 給藥0～6 h 期間，與空白組比較，模型組肛溫持續增加，3 h 之后體溫升高（P＜0.01），說明造模成功；與模型組相比，天南星組與模型組無顯著性差異，說明天南星并沒有解熱作用，符合天南星作為熱性藥的性質，膽南星組肛溫降低（P ＜0.05，P＜0.01），說明膽南星有良好的解熱作用；天南星組與膽南星組相比，于給藥2 h 后膽南星組肛溫低于天南星組（P＜0.05，P＜0.01），證明經加膽汁發酵炮制后，膽南星有良好的解熱作用，說明了膽汁以寒制熱的作用。見表2。

表2 各組藥物對各組SD 大鼠肛溫變化情況（，n=8）

表2 各組藥物對各組SD 大鼠肛溫變化情況（，n=8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；天南星發酵前后比較，aP＜0.05，aaP＜0.01。

3.2.2 天南星發酵前后對大鼠下丘腦組織中前列腺素E2（PGE2）的影響 與空白組相比，模型組大鼠下丘腦組織中PGE2水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，天南星組水平相差不大，膽南星組水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；天南星組與膽南星組相比，膽南星組低于天南星組（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

3.2.3 天南星發酵前后各給藥組血清中炎癥因子白胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1 β（IL-1 β）的表達 與空白組相比，模型組IL-6、IL-1 β 水平顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，天南星組IL-6、IL-1 β 水平相差不大，膽南星組IL-6、IL-1 β 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；天南星組與膽南星組相比，膽南星組IL-6、IL-1 β 水平低于天南星組（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 藥物對SD 大鼠下丘腦組織PGE2 及血清IL-6、IL-1β 的影響（，n=8）

表3 藥物對SD 大鼠下丘腦組織PGE2 及血清IL-6、IL-1β 的影響（，n=8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；天南星發酵前后比較，aP＜0.05，aaP＜0.01。

3.2.4 天南星發酵前后各給藥組肝臟組織中鈉鉀ATP 酶（Na+/K+ATPase）、琥珀酸脫氫酶（SDH）以及肝糖原（Glycogen）的代謝 與空白組相比，模型組大鼠肝臟組織中Na+/K+ATPase、SDH 水平增加，Glycogen 水平降低（P＜0.05，P ＜0.01）；與模型組相比，天南星組Na+/K+ATPase、SDH 以及Glycogen 水平相差不大，膽南星組Na+/K+ATPase、SDH 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），Glycogen水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；天南星組與膽南星組相比，膽南星組Na+/K+ATPase、SDH 水平降低，Glycogen 水平高于天南星組（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 藥物對大鼠肝臟組織中Na+/K+ATPase、SDH、Glycogen 代謝的影響（，n=8）

表4 藥物對大鼠肝臟組織中Na+/K+ATPase、SDH、Glycogen 代謝的影響（，n=8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；天南星發酵前后比較，aaP＜0.01。

由以上肛溫變化情況、下丘腦體溫調節中樞、肝臟組織能量代謝以及血清中炎性因子的對比，能夠發現天南星組與模型組相比無顯著性差異，說明天南星是熱性藥，無解熱作用。膽南星與模型組有顯著性差異，且向空白組接近，說明膽南星具有良好的解熱作用。

3.3 天南星發酵前后毒性作用結果 各組動物在第二次灌胃后6 h 內均出現不同程度的怠動、豎毛、聚堆、靜止俯臥、呼吸急促或呼吸困難、身體震顫、抽搐至死亡。對死亡動物立即解剖，可見小鼠胃腸均有大量尚未吸收的藥液，個別小鼠胃底部有充血現象，其余臟器未見有明顯異常。第二次灌胃6 h 后大部分存活動物開始逐漸進食飲水，第三天開始各組小鼠飲食進水恢復正常。天南星本身具有毒性，可致小鼠死亡，且天南星鮮品組死亡率高于天南星組，說明天南星經發酵炮制后，可有效降低死亡率，使毒性降低。見表5。

表5 藥物對動物死亡情況的影響

4 討論

天南星經發酵制成膽南星后，藥性由溫轉涼，毒性降低。這一炮制作用在古代各大醫書中均有大量記載，但在現代研究中，欠缺炮制前后藥效及毒性對比研究，無法解釋其炮制原理。抗高熱驚厥和清熱作為膽南星典型的藥理作用，能夠直觀的對比出兩者在傳統藥效方面的區別，比較貼合膽南星實際應用情況；毒性實驗則能直觀的對比出兩者毒性強弱。所以本實驗從藥效和毒性兩方面系統闡述了天南星炮制前后的變化，從而驗證天南星發酵“減毒改性”的炮制原理。

膽南星臨床上常用于治療小兒高熱驚厥［11]，故本實驗模擬小兒高熱致驚厥的模型，選用幼齡的SD 大鼠，并用熱水浴誘發驚厥，以最大程度的還原膽南星在臨床中的應用情況［12]。將驚厥發生率作為最直接的觀察指標用以評價抗驚厥作用強弱。膽南星抗高熱驚厥作用明顯強于天南星，膽南星不僅在抗驚厥作用上強于天南星，還可降低肛溫上升速度，從側面輔助證明了膽南星的解熱作用。

解熱作用機理之一是使下丘腦體溫調節中樞的PGE2水平降低［13]，或使大鼠肝組織Na+/K+ATPase 的水平降低、SDH 活力降低、升高肝糖原水平，而IL-6、IL-1 β 作為重要的抗炎癥細胞因子［14-16]，發熱會導致其水平增加，故解熱實驗中選定上述指標進行比較。對于干酵母所引起的發熱，膽南星組可有效降低大鼠體溫，降低發熱大鼠的PGE2、Na+/K+ATPase、IL-6、IL-1 β 和SDH 水平，增加肝糖原含量，而天南星則未表現出解熱作用。說明天南星在加入膽汁進行發酵制成膽南星后，具備了膽汁中寒涼的藥性，產生了解熱作用，體現了熱性藥向寒性藥的轉變，證明了炮制改性的原理。

因為在產地采收、加工天南星鮮品時，天南星鮮品表現出極明顯的對皮膚的刺痛作用，我們在對比天南星、膽南星毒性時增加了天南星鮮品組。預實驗表明，天南星鮮品有明顯的毒性，而天南星、膽南星組均受給藥體積和濃度的限制，給到最大濃度仍然無法致全部死亡，無法得到Dm、Dn、LD50等數據，故正式實驗對不同樣品對小鼠致死率進行了比較。結果表明，天南星鮮品具有明顯的毒性，經干燥后毒性有所降低，進一步發酵制成膽南星后毒性大大降低，體現了天南星的“炮制減毒”。

本實驗通過對天南星發酵前后的傳統藥效及毒性比較，證明了天南星發酵炮制后藥性由熱轉涼，增強抗高熱驚厥作用，產生顯著的解熱作用，并使毒性降低，驗證了炮制“減毒改性”的原理。