基因編輯技術在柑橘中的應用研究進展*

孫立方，徐建國，柯甫志

（浙江省柑橘研究所，國家柑橘品種改良中心浙江分中心，臺州 318026）

常規育種方法已成功地用于柑橘品種改良和新品種的培育，但由于柑橘植株大、童期長、雜交或自交不親和、遺傳雜合度高、多胚以及單性結實等特性給常規育種工作帶來很多困難和限制[1]。因此，常規育種很難在短期內培育具有理想性狀的新品種。與常規育種相比，基因工程育種能高效地對植物進行定向改良，縮短育種周期，逐漸成為柑橘定向育種和研究工作的重要手段。近10 余年來，以轉基因技術為主的基因工程育種在柑橘抗病育種、抗非生物逆境脅迫以及改良柑橘果實性狀等方面的研究已成功取得了一系列進展[2-4]。

作為常規基因工程育種技術的核心，轉基因技術雖然可以調控植物中目標基因的表達，但無法實現對目標基因的精準編輯，導致其在基因工程育種的應用過程中受到了一定的限制[5]。基因編輯技術是繼轉基因技術之后興起的能夠對特定基因位點實現精確編輯的一種基因修飾技術，此項技術的出現為作物的遺傳改良和植物基因功能等研究提供了新的思路與途徑[6]。據報道顯示，作為目前最高效的基因組編輯工具，CRISPR/Cas 系統自2013 年首次被應用于植物以來[7-8]，已經成功在24 個科的45 個屬植物中應用，包括模式植物、主要作物、園藝及藥用植物等[9]。本文介紹了基因編輯技術的發展過程以及CRISPR/Cas 系統的種類和技術優勢，綜述了CRISPR/Cas 系統在柑橘基因工程育種等研究中的應用進展，并對基因編輯系統目前在柑橘育種應用中存在的問題以及未來的發展趨勢進行了探討。

1 基因編輯技術的發展與應用

基因編輯系統根據序列特異性核酸酶的不同，可以分為3 類：鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator like effector nuclease，TALENs）、基于Ⅱ型簇狀規則間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關蛋白開發的CRISPR/Cas 系統[10]。這3 類基因組編輯系統的作用原理類似，均首先在基因組中產生DNA 雙鏈斷裂（DSB），然后通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）途徑修復，但由于這3 類核酸酶在結構、活性和酶作用機制上存在差異，導致靶點選擇、效率、特異性和突變特征的差異[10]。其中，ZFNs 和TALENs 在早期的基因組編輯技術中占主導地位，但由于這2 項技術受效率低和適用物種范圍小等限制，未能被廣泛地應用[11]。而新開發的CRISPR/Cas 基因編輯系統是基于RNA引導的核酸酶，與ZFNs 和TALENs 相比，具有簡單、高效和多功能性等優勢，成為近年來最主流的基因編輯技術[12]。CRISPR 系統是一種復雜的適應性免疫機制，存在于細菌和古細菌中，用于防御入侵的噬菌體和外源性DNA[13]，它于1987 年首次在大腸埃希菌的基因組中被發現[14]。根據其Cas 基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas 系統被分為兩大類，并根據其特征基因進一步細分為6 類：I 類CRISPR/Cas 系統（I、III、IV 型）利用多Cas 蛋白復合物進行靶位點的切割，而II 類CRISPR/Cas 系統（II、V、VI 型）利用單個Cas 蛋白與CRISPR-RNAs（crRNAs）形成的復合物對靶位點進行破壞。在CRISPR/Cas 不同類別的系統中，屬于II 型的CRISPR/Cas9 系統是目前技術最成熟的基因編輯系統[12]。

隨著技術的改進和優化，CRISPR/Cas 系統已從最初的CRISPR/Cas9 發展到現在的多個變種及新的編輯系統，如CRISPR/Cas9 系統及變種（SpCas9、SaCas9、FnCas9、dCas9 和xCas9）、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13 系統等[15]。這些CRISPR/Cas 系統的優化和新系統的開發解決了 PAM（protospacer adjacent motif）位點和編輯效率等限制，進一步為植物基因組精確編輯提供了更多的選擇。然而，在植物細胞中，由于同源重組頻率偏低和DNA 供體遞送困難，CRISPR 介導的HDR 效率顯著受限，往往也難以實現高效的基因組精確編輯[16]。為提高編輯效率和精準性，植物中以CRISPR/Cas 為基礎的基因編輯系統不斷被優化與升級。堿基編輯（base editing）系統是新近發展的不依賴于HDR 而通過堿基精確替換的新型基因編輯技術，目前主要包括兩類：胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）與腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE），可分別實現C-T（G-A）或A-G（T-C）的堿基替換，自開發以來已被迅速地應用于植物中[17-18]。2019年，Anzalone 等開發了不同于堿基編輯的基因組精準編輯技術，即引導編輯（prime editing）系統[19]。在此基礎上，國內學者高彩霞等構建了適于植物表達的引導編輯工具，并成功地在水稻和小麥中完成了DNA 精準編輯[20]。除了針對Cas9 蛋白本身進行優化外，還有研究通過降低Cas9 在體內活化的時間以降低其脫靶效應，如直接向植物細胞內遞送sgRNA 和Cas9 蛋白的核糖核苷酸蛋白（RNP）復合物來實現基因編輯[21]。以上這些基因編輯系統經過不斷地優化與改進，逐漸創制出具有高效、不依賴HDR和無外源DNA插入等優勢的多用途編輯工具，為植物基因組編輯提供了新路徑。下面將詳細介紹CRISPR/Cas 介導的基因組編輯系統在柑橘中的應用研究進展。

2 基因編輯技術在柑橘中的應用進展

2.1 柑橘中CRISPR/Cas 基因編輯系統的建立和應用

除模式植物和主要作物外，CRISPR/Cas 介導的基因編輯系統已在多種木本果樹中成功運用[22-24]。在柑橘中，Jia 等首次將CRISPR/Cas9 系統應用于‘伏令夏橙’（Citrus sinensis Valencia）和‘鄧肯葡萄柚’（Citrus paradisi Macf.）中CsPDS 基因的靶向編輯，通過黃單胞桿菌亞種（Xanthomonas citri subsp.citri，Xcc）輔助的農桿菌侵染和瞬時轉化方法將Cas9 蛋白和一種合成的sgRNA 導入柑橘，并成功地修飾了CsPDS 基因[24]。測序結果證實了甜橙葉片中 CsPDS 基因在靶位處發生了突變，但Cas9/sgRNA 的編輯效率較低，為3.2%～3.9%，沒有檢測到脫靶效應[24]。經后期優化，柑橘中建立了穩定的CRISPR/Cas 基因編輯系統[25]，并在柑橘抗病育種及基因功能等研究中成功應用（表1）。

表1 基因編輯系統在柑橘中的應用

柑橘潰瘍病由柑橘黃單胞菌亞種引起，是一種非常嚴重的細菌性病害，廣泛分布于全球柑橘產區，嚴重影響多數柑橘品種及重要的經濟品種，如柑橘、柚、甜橙、檸檬和柑橘砧木等[38]。CsLOB1是一個柑橘側生器官邊界基因（citrus lateral organ boundaries 1），為植物LBD（Lateral organ boundaries domain）轉錄因子家族成員，已經被證明是柑橘潰瘍病的關鍵感病基因[39]。柑橘潰瘍病致病菌Xcc 菌株編碼轉錄激活類（Transcription activator-like，TAL）效應子PthA4，該效應子可與CsLOB1 基因啟動子中的效應子結合元件（EBE）結合并誘導CsLOB1 基因的表達[39]。因此，研究人員嘗試通過利用CRISPR/Cas 系統對CsLOB1 基因進行編輯，來提高柑橘對潰瘍病的抗性。最初研究發現，基于CRISPR/SpCas9 對‘鄧肯葡萄柚’中Type I CsLOB1基因EBE 元件的修改，只輕微緩解潰瘍病癥狀，并沒有獲得對潰瘍病抗性較強的突變株系，可能由于單個堿基的改變沒影響EBE 結合元件的功能造成的，也可能因為雜合葡萄柚中另一個等位基因Type II CsLOB1 中的EBE 元件功能正常引起的感病[26]。因此，為保證對CsLOB1 及等位基因啟動子的編輯效率，后續有研究將5 個Cas9/CsLOB1sgRNA 載體同時成功轉入‘晚錦橙’（Citrus sinensis Osbeck），并有效地對CsLOB1 及等位基因中EBE 元件編碼序列進行編輯（刪除或突變），編輯效率為11.5%～64.7%，其中CsLOB1 整個EBEs 編碼序列刪除的純合突變株系對潰瘍病表現出高度抗性[27]。此外，Jia等還在另一項研究中發現，利用CRISPR/SpCas9 編輯CsLOB1 及等位基因的編碼區獲得的‘鄧肯葡萄柚’株系也增強了對潰瘍病的抗性，編輯效率為31.58%～89.36%[28]。國內還有研究利用CRISPR/ Cas9 系統對CsLOB1 啟動子進行多位點編輯，并獲得了較大DNA 片段刪除的突變體，基因編輯效率高達80.0%[29]。在CRISPR/SpCas9 基礎上優化和新開發的基因編輯系統在柑橘中也已被成功應用，如Jia 等近期還利用密碼子優化的SpCas9（SpCas9p）系統來修飾純合的柚（Citrus maxima）中LOB1 基因啟動子的EBE 區域，并成功在T0代獲得等位基因純合突變的抗潰瘍病株系[30]，這對縮短柑橘轉基因抗病育種的周期具有重要意義。另外，一個新開發的II類CRISPR/Cas系統V型核酸內切酶CRISPR/ LbCas12a（LbCpf1）被成功用于對‘鄧肯葡萄柚’基因CsLOB1 及等位基因中EBE 元件編碼序列的編輯，并獲得了對Xcc 具有抗性的突變植株[31]。除對CsLOB1 基因進行編輯外，近期 Wang 等利用CRISPR/Cas9 系統對‘晚錦橙’中病原觸發免疫標記基因CsWRKY22 進行了敲除，獲得了68%的突變率，抗性鑒定證實CsWRKY22 基因敲除同樣降低了柑橘對潰瘍病的易感性[32]。這些研究報道表明，利用CRISPR/Cas 基因編輯系統對柑橘中潰瘍病感病基因等進行編輯后，均成功提高了柑橘對潰瘍病的抗性。不僅抗病育種，CRISPR/Cas 介導的基因編輯系統在柑橘基因功能研究中也有應用。例如，Jia等利用 CRISPR/SaCas9 系統成功編輯枳橙中的Cs7g03360 基因，該基因為番茄中參與調控葉片發育的SlAgo 基因的同源基因，并獲得基因編輯效率為15.55%～79.67%的12 個枳橙突變株系，但可能由于這些突變株系并非純合體導致均未出現葉片變化的表型[33]。近期，Zhang 等利用CRISPR/AtYAO:hSpCas9 系統對‘卡里佐枳橙’（Citrus sinensis×Poncirus trifoliata）中的THORN IDENTITY 1（TI1）和TI2 基因進行編輯，來研究二者在針刺發育成枝過程中的作用，發現編輯后的枳橙突變體中部分針刺可以發育轉變成枝，增加了植株分枝數量[34]。

雖然CRISPR/Cas 介導的基因編輯系統在柑橘中已成功應用，上述這些報道也表明，與其他植物相比，CRISPR/Cas 系統在柑橘中的編輯效率整體較低，且獲得突變植株后代的周期較長。因此，有研究人員在提高柑橘中的基因編輯效率和開發模式柑橘等方面也做了一些嘗試工作。與CaMV35S 啟動子相比，Cas9 在擬南芥YAO 啟動子驅動下的表達增加了特定位點的靶向突變數量[40]。鑒于此，有研究構建了擬南芥YAO 啟動子驅動的Cas9 載體AtYAO :Cas9，對枳橙中CsPDS 基因進行編輯，研究結果表明該系統穩定高效，編輯效率為45.5%～75.0%[35]。短期熱脅迫處理被認為是提高編輯效率的有效方法[36]。在經過37 ℃熱激處理后，柑橘植株的突變率和擬南芥一樣也明顯增加，為45%～100%，這可能是因為隨著溫度升高導致spCas9 活性升高和gRNA 表達水平增加，并引起編輯效率的提升[36]。另外，上述報道的柑橘中CRISPR/Cas9 介導的靶向突變多以甜橙或柚為材料，但由于這2 個種類多胚和童期長的特性，這些研究發表時均還沒有獲得T1代的轉化材料，這類問題也是柑橘基因工程育種的一個巨大阻礙。近期，國內學者首次報道了一個基于早花‘山金柑’（Fortunella hindsii）建立的實用CRISPR/Cas9 系統，它大約需要15 個月即可產生T1代轉化材料，極大地縮短了基因工程育種的周期[37]。不過，與上述一些研究報道相比，‘山金柑’的基因編輯效率相對較低（平均約50%），這可能是由于轉化載體差異或金柑本身的自然特性造成的?！浇鸶獭幕蚪M測序也已經完成，單胚和童期短的特性使之可能成為柑橘分子生物學研究的一個“模式柑橘”。編輯效率的提高和“模式柑橘”的開發將進一步擴大CRISPR/Cas 基因編輯系統在柑橘中的應用范圍。

2.2 CRISPR/Cas9 系統在柑橘病害傳播媒介木虱（ACP）中的應用

柑橘黃龍病（Huanglongbing，HLB）是目前柑橘生產上危害最為嚴重的病害，影響范圍覆蓋全球主要柑橘產區，以植物韌皮部汁液為食的半翅目昆蟲柑橘木虱（Asian citrus psyllid，ACP）Diaphorina citri 為主要傳播媒介[41]。近年來，研究人員發現CRISPR 基因編輯技術在柑橘病毒性細菌病的載體管理方面具有巨大的潛力[42]。有研究報道CRISPR/Cas9 基因編輯技術被用來對柑橘黃龍病傳播媒介ACP 中的硫氧還蛋白基因（TRX-2）進行敲除，結果發現TRX-2 基因被編輯突變后導致木虱發育延緩、生命周期縮短，而且繁殖力降低[43-44]。這些研究結果表明，利用CRISPR/Cas 介導的基因編輯技術降低依靠昆蟲傳播媒介的柑橘病害有潛力成為一種可持續和環境友好的抗病策略。

3 討論與展望

基因編輯技術已經成為植物品種改良、抗病育種和基因功能等研究的高效工具。與常規轉基因技術相比，基因編輯系統有助于在植物基因組中引入穩定的遺傳位點修飾，并創造非轉基因植物[45-46]，避免了轉基因育種材料面臨的諸多限制。目前，CRISPR/Cas 介導的基因編輯系統已在柑橘、蘋果、葡萄、梨、獼猴桃等木本果樹中成功應用[22-24]。其中，CRISPR/Cas9 及其變種系統在柑橘的應用主要集中在體系的建立、潰瘍病感病基因的編輯和功能基因研究等方面，成功在多個品種中建立穩定、高效的基因編輯體系，并獲得一些抗潰瘍病的柑橘基因編輯（突變）株系。然而，CRISPR/Cas 系統在柑橘的應用中還面臨著一些限制和挑戰。例如，除潛在的脫靶效應和非靶向突變[33]，柑橘的多倍體和雜合特性對CRISPR/Cas 系統的應用也極為不利。一些研究已經證明，多倍體雜合植株的基因編輯效率通常較低，為達到敲除效果還須同時編輯多個等位基因[29,47]，增加了獲得純合突變株系的難度?；蚓庉嬒到y在柑橘中應用面臨的另一個重要挑戰是缺乏適用不同品種的高效轉化方法和傳遞技術。遺傳轉化方法往往局限于特定的組織和培養類型，并不能應用于所有柑橘品種，不同品種間轉化和組織再生效率有很大差異。目前，基因編輯系統的元件主要通過農桿菌介導的傳遞系統轉化導入柑橘外植體的細胞，并通過耗時的組織培養方法獲得植株的再生后代。

近年來，隨著CRISPR/Cas 基因編輯技術的改進和創新，一些更高效和精準的基因編輯系統不斷出現。因此，加速將在CRISPR/Cas9 基礎上開發的新的變種系統、堿基編輯和引導編輯等系統在柑橘中的應用進程，以此來解決編輯效率和潛在的脫靶效應等相關問題。而且，從目前研究面臨的限制來看，優化現有的遺傳轉化方法和開發更高效的傳遞系統是進一步促使CRISPR/Cas 基因編輯技術在柑橘育種中廣泛應用亟待解決的問題。除農桿菌介導的轉化方法外，Cas9/sgRNA 核糖核蛋白復合物（RNP）可以通過原生質體轉化的方式直接導入細胞內，既提高了編輯效率，又可以很好地解決外源DNA 的插入問題，但該技術受原生質體制備、轉化和再生體系的限制[48-50]。所以，開發不同柑橘品種的單細胞轉化方法和再生體系，將有助于加快基因編輯介導的育種進程。隨著技術的發展，新興的納米載體逐漸成為CRISPR/Cas 系統元件的潛力遞送工具。已經有報道利用納米材料作為載體，成功將外源DNA 和CRISPR/Cas 元件導入植物花粉或原生質體[51-52]，這種傳遞方式不僅避開了轉化和組培過程，還可能解決品種特異性對植株再生的限制。近期還有研究報道了使用RNA 病毒載體表達可移動的sgRNA 和從頭誘導分生組織的方法，獲得基因編輯植株的后代[53]。納米材料傳遞載體和分生組織的誘導編輯等這些不需要組織培養的轉化方法，將成為植物基因編輯未來發展的一種趨勢，但其是否同樣適用于柑橘，也有待研究證實。相信隨著柑橘重要性狀調控基因和病害相關等基因的挖掘，CRISPR/Cas 基因編輯技術勢必將成為柑橘基因工程育種等研究廣泛應用的一個重要工具。